1、背景 目前看來，冠心病的發(fā)病率逐年增加，其直接的后果是心肌供血減少導(dǎo)致細(xì)胞死亡或功能受損，從而產(chǎn)生心功能損害，嚴(yán)重時(shí)造成心力衰竭。 干細(xì)胞是一族具有自我復(fù)制和多向分化能力的細(xì)胞。已有許多的臨床前期試驗(yàn)表明干細(xì)胞治療可能通過修復(fù)或再生受損心肌，增強(qiáng)血管新生等作用，縮小心肌梗死的面積，改善心功能。最近研究將某些類型的干細(xì)胞通過細(xì)胞移植的方法種植到病變區(qū)域，使其增生分化為心肌細(xì)胞和/或血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而增加和恢復(fù)具有完善收

2、縮功能的心肌細(xì)胞數(shù)目，逆轉(zhuǎn)心室重塑，取得了鼓舞人心的成就。 雖然干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病已成為新的研究熱點(diǎn)，但也存在不少問題，如：移植干細(xì)胞的類型、移植方法、移植時(shí)間的選擇等等。本研究從以下兩個(gè)大的方面展開：(1)骨髓干細(xì)胞能否在梗死心肌內(nèi)存活并且分化成為新的心肌細(xì)胞從而改善心功能?(2)缺血/再灌注后移植干細(xì)胞有否良好作用。 目的： (1)建立心肌梗死及缺血/再灌注模型；(2)觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)、

3、制備的過程及方法：(3)探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的方法、時(shí)機(jī)； (4)觀察標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞能否在梗死及再灌注心肌內(nèi)存活并且分化成為新的心肌細(xì)胞；(5)觀察骨髓干細(xì)胞移植對心功能改善及減輕再灌注損傷的作用。 方法： 1．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的制備及細(xì)胞標(biāo)記用離心的方法分離出大白鼠的股骨骨髓，淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)沖洗后，培養(yǎng)、傳代，得到第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(P3)，于培養(yǎng)液中加入終濃度為50ug/m

4、l的4,6二乙酰基-2-苯基吲哚(DAPI)，孵育，然后用Hanks平衡鹽液洗去未結(jié)合的DAPI。利用熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)同一個(gè)視野細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)目，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)lO個(gè)高倍視野取其平均值，計(jì)算二者的比值即得到DAPI的標(biāo)記率。 2．急性心肌梗死(AMI)和缺血/再灌注(CIR)動(dòng)物模型的制備將大白鼠充分麻醉后，固定、備皮、鋪單，在心電監(jiān)護(hù)和呼吸輔助的條件下，取胸骨正中切口，暴露心臟，以左心耳與肺動(dòng)脈圓錐間的左冠狀

5、靜脈主干為標(biāo)志結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(缺血/再灌注動(dòng)物模型結(jié)扎時(shí)絲線與心外膜之間放置一塑料軟管)，觀察前壁部分區(qū)域顏色變淺及心電圖有梗死改變即為AMI模型，抽出塑料軟管即為CIR模型。 3細(xì)胞移植：將動(dòng)物模型再次開胸，充分暴露心臟，把干細(xì)胞懸液以點(diǎn)注射的方式局部注射入梗死灶的周邊區(qū)，并以縫線標(biāo)記注射點(diǎn)后關(guān)胸。 4．超聲心動(dòng)圖檢測心功能： 選擇切面包括：心尖四腔、兩腔切面，左室長軸和短軸切面。測定參數(shù)包括：左室射血

6、分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率、左室舒張末期直徑、左室收縮末期直徑、左室舒張末期前壁厚度、左室收縮末期前壁厚度、左室舒張末期后壁厚度、左室收縮末期后壁厚度、主動(dòng)脈血流速度、心率。 5．免疫熒光檢查干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化過量麻醉處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，迅速取出心臟，取縫線標(biāo)記處的心肌制成8um厚的連續(xù)冰凍切片標(biāo)本，加入抗心肌a肌球蛋白重鏈(α-myosin heavy chain，a-MHO)作為一抗，然后滴加異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗鼠

7、IgG作為二抗，進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡檢查，檢測DAPI示蹤的細(xì)胞是否具有心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記抗α-肌球蛋白重鏈。DAPI測試參數(shù)：紫外光(UV)激發(fā)，Ex/Em：356nm/BP461，針孔：1.0；FITC測試參數(shù)：Argon激光，Ex/Em：488nm/BP505-550，針孔：1.0。 6.HE常規(guī)染色觀察 完整取出心臟，將房室溝以上部分完全剪去，觀察外形。然后將心肌置于10％福爾馬林內(nèi)浸泡固定24小時(shí)以上，1周內(nèi)

8、取出標(biāo)本，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋，制成蠟塊備用。切成4Um厚的切片，固定于多聚賴氨酸處理的防脫載玻片上。石蠟切片，常規(guī)脫蠟，置入Harris蘇木素液5分鐘左右，水洗1分鐘，75％鹽酸乙醇分化30秒，水洗，氨水處理30秒，水洗1分鐘，酸化伊紅乙醇液染12分鐘，自來水快速沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明后中性樹膠封固。在BH2型OLYMPUS照像顯微鏡下，以100～400放大倍率，觀察心肌組織結(jié)構(gòu)變化并選取典型視野照相。 7.用

9、左心導(dǎo)管檢查心功能充分麻醉大鼠，固定分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，插入內(nèi)充肝素生理鹽水的塑料管至左室腔，用多導(dǎo)生理記錄儀描記左室縮．舒壓差(LVEDP)、左室等容收縮/舒張期壓力上升或下降最大速率(±LVdp/dtmax)以反映左室收縮與舒張功能．所有電信號均用計(jì)算機(jī)軟件分析處理。 8梗死區(qū)心肌SOD和MDA水平測定采用過量戊巴比妥腹腔注射(100mg/Kg)處死，取出梗死區(qū)心肌組織約0.2g用生理鹽水沖洗干凈，眼科剪刀剪碎，置組織粉碎機(jī)上

10、粉碎研磨至糊狀，用生理鹽水配置成10％、1％的組織勻漿分別離心取上清，嚴(yán)格按照操作表進(jìn)行操作。 9．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究計(jì)量資料用x±s表示，所有分析均用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包完成，對計(jì)量資料采用小樣本t檢驗(yàn)，包括配對設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)和成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P≤0.05為有顯著意義。 結(jié)果： 1．標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞在梗死心肌內(nèi)存留并且分化為心肌樣細(xì)胞骨髓干細(xì)胞植入梗死心肌后4周，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的梗死

11、心肌冰凍切片內(nèi)，激光共聚焦顯微鏡下可見DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核呈藍(lán)色，這些細(xì)胞播散并遷移至整個(gè)梗死區(qū)域，正常心肌內(nèi)未見浸潤。合成紫外光(UV)激發(fā)和Argon激光激發(fā)的兩種熒光細(xì)胞圖像，可見細(xì)胞切面圖：DAPI示蹤的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，a-MHC抗體陽性的細(xì)胞漿呈現(xiàn)綠色熒光。 2．多功能超聲心動(dòng)圖檢查心功能本研究采用隨機(jī)分組，因此在基礎(chǔ)狀態(tài)下兩組大白鼠在術(shù)前所測LVDd、LVDs、LVFTd、LVFTs、EF、FS等心功能各項(xiàng)主要的

12、指標(biāo)均無顯著性差異。心肌的厚度、活動(dòng)度及回聲均無異常。在再次開胸注射骨髓干細(xì)胞/培養(yǎng)基后兩周，兩組動(dòng)物左室內(nèi)徑出現(xiàn)擴(kuò)大，EF及FS下降，并且兩組相比沒有顯著性差異。二維超聲在兩組均發(fā)現(xiàn)前壁部分區(qū)域運(yùn)動(dòng)減弱、厚度變薄及回聲增強(qiáng)，后壁代償性運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)、心肌略有增厚。于注射后4周開始，對照組左室內(nèi)徑繼續(xù)增大，EF及FS顯著下降，后壁代償?shù)某潭雀用黠@，二維切面上可以看到前壁部分區(qū)域有運(yùn)動(dòng)消失現(xiàn)象，部分可見巨大的室壁瘤形成。在細(xì)胞移植組，擴(kuò)大的左

13、室內(nèi)徑開始減小，EF及FS改善，同對照組相比有顯著性差異，二維超聲沒有發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)消失及室壁瘤形成。 3．蘇木素一伊紅(HE)常規(guī)染色于注射后2周開始觀察，對照組心肌細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)紊亂，核固縮明顯，染色加深，甚至溶解消失，發(fā)生灶性分布的玻璃樣變性，肌纖維斷裂，膠原增生，心肌組織逐漸被癱痕組織替代，未發(fā)現(xiàn)核漿比例大的細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞移植區(qū)域，可見炎癥細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)核漿比例較大、類似胎心或新生心室細(xì)胞的細(xì)胞，生長排列方向與肌纖維一致，

14、心肌細(xì)胞的纖維化被有效抑制，瘢痕組織形成較少見。 4．梗死區(qū)植入細(xì)胞的免疫熒光檢查細(xì)胞移植2周后，熒光顯微鏡顯示，所有干細(xì)胞移植組梗死區(qū)心肌組織標(biāo)本中均可見DAPI標(biāo)記的藍(lán)色熒光供體細(xì)胞核，分布比較廣泛，呈橢圓形，似心肌細(xì)胞核，并與心肌纖維排列方向一致，在藍(lán)色背景下細(xì)胞核深染，與其他細(xì)胞成分對比清楚；Argon激光激發(fā)條件下，心肌細(xì)胞胞漿呈綠色熒光。而在對照組，沒有發(fā)現(xiàn)有DAPI標(biāo)記的藍(lán)色熒光細(xì)胞核及綠色細(xì)胞胞漿。 5．

15、左心導(dǎo)管檢測心功能CIRI對照組和CIRI移植組左室收縮壓、左室壓最大上升速率均較假手術(shù)組明顯降低，而左室舒張壓、左室壓最大下降速率均較假手術(shù)組明顯升高(P≤0.01)；，CIRI移植組左室收縮壓、左室壓最大上升速率較CIRI對照組升高而左室舒張壓、左室壓最大下降速率較對照組下降(P≤0.01)。 6．心肌組織SOD及MDA檢測結(jié)果 與假手術(shù)組相比，CIRI對照組及CIRI移植組梗死區(qū)心肌組織中SOD活力明顯降低，MDA產(chǎn)生明

16、顯增多(P≤0.01)；CIRI移植組與CIRI對照組相比，SOD下降程度小，MDA產(chǎn)生的數(shù)量少(P≤0.01)。 結(jié)論 (1)經(jīng)心外膜注射移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是可行的。在本研究所做的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將操作方法略做改進(jìn)，AMI模型動(dòng)物經(jīng)注射干細(xì)胞后，均獲得存活，無一例出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。 (2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療對AMI后心肌的修復(fù)及心功能的改善效果確切。經(jīng)多重指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，梗死區(qū)有新生細(xì)胞生長，心功能各項(xiàng)參數(shù)明顯

17、改善。 (3)在AMI后1周移植干細(xì)胞效果好。在本研究中是在發(fā)生AMI后1周移植，效果良好，其他時(shí)間如：AMI后即刻，AMI再通后，AMI后2周或更長時(shí)間是否可行還有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究。 (4)干細(xì)胞移植較安全。移植后連續(xù)觀察12周沒有發(fā)生嚴(yán)重的并發(fā)癥，心肌上沒有形成其他異常組織。 (5)移植干細(xì)胞修復(fù)心肌及改善心功能的機(jī)制，本研究中沒有進(jìn)行探討。現(xiàn)在存在很多觀點(diǎn)，大多數(shù)的研究認(rèn)為其能增加心肌細(xì)胞及微血管的數(shù)量。