1、研究背景 細(xì)胞極性是多種不同類型細(xì)胞的基本特征，對(duì)多數(shù)細(xì)胞的功能發(fā)揮是必需的。細(xì)胞極性是指細(xì)胞為了行使特殊的生理功能或產(chǎn)生定向的分化，在胞內(nèi)的信號(hào)分子不對(duì)稱分布致使細(xì)胞在表型上的不對(duì)稱。具體表現(xiàn)為細(xì)胞的形狀、細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及產(chǎn)生極性所必需的細(xì)胞骨架等的不對(duì)稱分布，細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)重構(gòu)的變化。細(xì)胞極性形成的過程通常是由肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞皮質(zhì)所介導(dǎo)，在這一進(jìn)程中，細(xì)胞膜首先形成縐褶，同時(shí)在縐褶處肌動(dòng)蛋白聚集增加，從而形成一

2、個(gè)前極具有片足后極出現(xiàn)尾足的極化形態(tài)。細(xì)胞極性在細(xì)胞遷移、軸突生長、胚胎發(fā)育、血管發(fā)生、傷口修復(fù)等細(xì)胞基本生命活動(dòng)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。 中性粒細(xì)胞極性對(duì)于其生理功能的發(fā)揮有著重要的意義。臨床上多種疾病如敗血癥、哮喘、缺血/再灌注損傷和器官移植的排斥反應(yīng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及一些腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移都與中性粒細(xì)胞極性功能的增強(qiáng)和減弱有關(guān)。當(dāng)機(jī)體遭受外來細(xì)菌和其他病原體入侵時(shí)，中性粒細(xì)胞充當(dāng)了機(jī)體的第一道防線，這種作用是建立在細(xì)胞

3、的極性和趨化性基礎(chǔ)上的。在各種趨化物的作用下，中性粒細(xì)胞憑借胞內(nèi)分子對(duì)極化信號(hào)的優(yōu)化和放大，能夠準(zhǔn)確向炎癥部位形成極性化，并最終向此處遷移，而中性粒細(xì)胞極性是這種定向遷移功能的前提條件。 目前有關(guān)中性粒細(xì)胞極性形成機(jī)制的研究主要包括參與胞內(nèi)極性形成的信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究，參與胞內(nèi)鈣離子(Ca<'2+>)信號(hào)調(diào)節(jié)的鈣庫操縱性鈣離子流入(SOCE)機(jī)制的探討以及胞膜上的特殊脂質(zhì)結(jié)構(gòu)脂筏在其中的作用。但中性粒細(xì)胞極性各種機(jī)制之間的關(guān)系

4、，尤其是參與SOCE機(jī)制的瞬時(shí)受體電位離子通道(TRP)在極化過程中的明確作用，以及其與脂筏的相互聯(lián)系還有待于進(jìn)一步探討。 目的 1．采用4℃溫度對(duì)急性分離的人外周血嗜中性粒細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，探討溫度處理對(duì)細(xì)胞的極性和膜通道有何影響。 2．探討均一濃度的趨化劑fMLP對(duì)中性粒細(xì)胞極性形成的影響。 3．探討fMLP誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca<'2+>]<,i>)變化與細(xì)胞極性化過程啟動(dòng)

5、的關(guān)系。 4．探討TRPCI和脂筏在fMLP誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞極性中的作用及二者之間的關(guān)聯(lián)性。 方法 1．采用重復(fù)梯度密度離心的方法分離中性粒細(xì)胞，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)和瑞氏染色，分析細(xì)胞的活性和純度。分離后的細(xì)胞進(jìn)行4℃溫度預(yù)處理。通過倒置顯微鏡觀察fMLP誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的變化情況，采用單通道和全細(xì)胞模式膜片鉗記錄中性粒細(xì)胞的鉀通道的電流活動(dòng)。 2．采用激光共聚焦顯微鏡測(cè)量中性粒細(xì)胞[Ca<'2+>]<,

6、i>。 3．應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)對(duì)照組、fMLP刺激組和脂筏破壞后fMLP刺激組的TRPCI的表達(dá)情況。 4．使用超高速冷凍離心機(jī)分離脂筏，并應(yīng)用Western-blotting方法檢測(cè)對(duì)照組、fMLP刺激組和脂筏破壞后fMLP刺激組的TRPCI蛋白在脂筏中的含量變化。 結(jié)果 1．中性粒細(xì)胞分離后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞的活性大于94％，瑞氏一姬姆薩染色，細(xì)胞純度大于95％。對(duì)分離后的細(xì)胞進(jìn)行

7、4℃溫度預(yù)處理，結(jié)果表明4℃溫度預(yù)處理的細(xì)胞出現(xiàn)片足的時(shí)間(45.93±7.87msec，n=35)和常溫組(33.75±6.02msec，n=28)相比有顯著性差異(P<0.01)。4℃溫度預(yù)處理的細(xì)胞極性周期所用時(shí)間(538.26±27.74sec，n=23)和常溫組(260.25±25.87sec，n=23)相比有顯著性差異(P<0.01)。全細(xì)胞模式記錄溫度預(yù)處理和常溫對(duì)照組中性粒細(xì)胞的電壓依賴性鉀電流，兩組的Ⅰ-Ⅴ曲線，電流幅

8、度均隨鉗制電位升高而增高，電流幅度沒有顯著性差異(n=5，P>0.05)。采用單通道記錄BKCa電流，兩組細(xì)胞的電導(dǎo)值大約為210pS(n=3，P>0.05)。在鉗制電位為40mV、60mV、80mV下，溫度處理組和常溫組的 NPo分別進(jìn)行t檢驗(yàn)，兩組之間均沒有顯著性差異(n=30，P>0.05)。2.在三種濃度(10nM，50nM，100nM)下的fMLP激活中性粒細(xì)胞，極化中性粒細(xì)胞的50％極化率所用的時(shí)間(51.16±6.49se

9、c，45.83±4.95sec，37.33±5.16sec；n=6，P<0.01)，偽足的平均極化長度(1.62±0.050μm，1.73±0.036μm，1.81±0.027μm；n=30，P<0.01)以及極性振蕩周期(209.37±17.70sec，n=52；234.00±21.42sec，12=50；286.15±19.44sec，n=52；P<0.01)均具有顯著性差異。三種濃度下的偽足延伸率(0.067±0.0073μm/s

10、ec，0.107±0.0086μm/sec，0.120±0.0132μm/sec；n=30，P<0.01)，縮短率(0.051±0.0050μm/sec，0.091±0.0051μm/sec，0.110±0.0142μm/sec；n=30，P<0.01)和變化率(0.057±0.0071μm/sec，0.099±0.0059μm/sec，0.114±0.0124μm/sec；n=30，P<0.01))也均具有顯著性差異。 3.

11、加入fMLP(100nM)后對(duì)應(yīng)于[ca<'2+>]<,i>變化的不同時(shí)相，即靜息期(Osec)、快速上升期(10sec)、快速下降期(150sec)、慢速下降期(250sec)和終術(shù)期五個(gè)階段，而中性粒細(xì)胞表現(xiàn)為極性化和去極性化狀態(tài)的交替出現(xiàn)。 4.SKF96365(10μM)和mBCD(10mM)能抑制fMLP誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞[Ca<'2+>]<,i>增加及中性粒細(xì)胞的極化形態(tài)的形成。 5.正常中性粒細(xì)胞的TRPC

12、I是在膜均勻的表達(dá)，而fMLP(100nM)組TRPCI明顯聚集到細(xì)胞的片足位置，但fMLP+mβCD組TRPCI沒有出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。同時(shí)使用Western-blotting技術(shù)檢測(cè)三組的TRPCI蛋白在脂筏和非脂筏的含量變化，在非脂筏層，對(duì)照組(289.00±8.00)和fMLP+mβCD組(283.33±6.02)的TRPCI的表達(dá)比fMLP組(76.00±7.00)顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3，P<0.01)；而在脂筏層，f

13、MLP組(215.00±6.55)的 TRPCI的表達(dá)比對(duì)照組(0.00±0.00)和fMLP+mβCD組(21.33±5.68)顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3．P<0.01)。 結(jié)論 1．采用4℃溫度預(yù)處理分離后的中性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞極性明顯抑制，而離子通道的功能活動(dòng)不受影響，因此4℃溫度預(yù)處理可以減少中性粒細(xì)胞自發(fā)極化的發(fā)生，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供良好的細(xì)胞來源； 2．建立了一組評(píng)價(jià)細(xì)胞極性變化的指標(biāo)，根

14、據(jù)指標(biāo)所得數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞極性形成對(duì)fMLP有時(shí)間和濃度的依賴性； 3．本實(shí)驗(yàn)顯示不同濃度趨化劑fMLP誘導(dǎo)的[Ca<'2+>]<,i>變化沒有顯著性差異，而中性粒細(xì)胞極性化周期與fMLP濃度有關(guān)，進(jìn)一步揭示了[Ca<'2+>]<,i>的升高與中性粒細(xì)胞極性化啟動(dòng)機(jī)制有關(guān)； 4．證明了SOCE機(jī)制和脂筏參與了fMLP誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的極性形態(tài)的產(chǎn)生及[Ca<'2+>]<,i>升高過程，進(jìn)一步闡明了中性粒細(xì)胞極性化過程