1、第一部分Y染色體新STR基因座的篩選 1.前言Y染色體是男性特異染色體，除去其兩端約3Mb的區(qū)域可以和X染色體進(jìn)行重組外，其它區(qū)域不會(huì)在減數(shù)分裂時(shí)和同源染色體發(fā)生重組，叫非重組區(qū)(NRY,non-recombiningregionoftheYchromosome。又稱男性特異區(qū)(MSY，manspecificregionoftheYchromosome)。曾經(jīng)認(rèn)為Y染色體除了決定性別外沒有其它作用，現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)Y染色體上有許多

2、重要功能基因。由于不會(huì)發(fā)生重組，除非發(fā)生突變，一個(gè)男性的所有后代均含有同樣的Y-染色體遺傳標(biāo)記構(gòu)建的單倍型。這些性質(zhì)使Y染色體成為研究許多領(lǐng)域的重要工具。Y染色體的遺傳標(biāo)記有小衛(wèi)星序列(MSY)，微衛(wèi)星序列Microsatellite，MS)，單核苷酸多態(tài)性(SNP)，等。其中的微衛(wèi)星序列，或稱為短串連重復(fù)(STR)，是以2-6bp為核心序列的串連重復(fù)。它們的多態(tài)性高，片段短，分型容易，還具有男性伴性單倍型遺傳的特點(diǎn)，在法醫(yī)學(xué)、進(jìn)化學(xué)、

3、群體遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)等領(lǐng)域都有重要價(jià)值。 在法醫(yī)學(xué)方面，用Y-STR分析可以進(jìn)行性犯罪案件中收集到的混合斑的個(gè)人識(shí)別。用常染色體STR分析可以進(jìn)行混合斑的個(gè)人識(shí)別，但是要分離精子和女性的成分，不總是成功。如果男性是輸精管結(jié)扎或者無精癥患者，就完全不能用這種方法。在一些檢材，如含多個(gè)男性精子，各種體液形成的混合斑(來源于不同性別)等，的鑒定中，Y-STR是很有用的工具。親權(quán)鑒定時(shí)，如果超過兩代，用常染色體來進(jìn)行親權(quán)鑒定很困難。在

4、這兩種情況下，Y-STR是一種很有用的工具。 Y-STR的研究主要集中在幾個(gè)方面。首先是發(fā)現(xiàn)更多的Y-STR基因座，并闡明其基因座特點(diǎn)。由于沒有交換，是單倍型遺傳，所以需要用更多的Y-STR基因座才能得到足夠的信息，比如法醫(yī)學(xué)上對(duì)個(gè)人識(shí)別能力和父權(quán)排除率的要求。有了更多的Y-STR，排除男系親屬的能力會(huì)增加。第二，突變率和突變機(jī)制的研究。用突變率可以對(duì)人類進(jìn)化時(shí)間進(jìn)行定量研究。在法醫(yī)學(xué)上，有了對(duì)突變率和突變機(jī)制的深刻了解，可以更

5、準(zhǔn)確的解釋結(jié)果，下更精確的結(jié)論。第三，研究其在不同群體內(nèi)的基因頻率和單倍型頻率。這是其在各方面，特別是法醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用基礎(chǔ)，由于Y染色體容易受到選擇性清除和遺傳漂變的影響，其基因頻率和單倍型頻率更容易在不同群體間產(chǎn)生差異。因而尋找更多的多態(tài)性高的Y-STR基因座具有重要意義。 為了查找新的Y-STR基因座，用已經(jīng)完成的Y染色體DNA序列為對(duì)象，尋找STR基因座，并對(duì)其基因座特點(diǎn)進(jìn)行研究，同時(shí)調(diào)查了等位基因頻率和單倍型頻率在漢族人

6、群體中的分布。 2.新Y-STR的查找。在Y染色體的X染色體退化序列(X-degenerate)序列中，選擇AC006989(157666bp)和AC011289(80537bp)作為查找新STR基因座的區(qū)域。用Tandemrepeatsfinder軟件，查找重復(fù)單位為3-6bp，完整連續(xù)重復(fù)8次以上的微衛(wèi)星。共查到8個(gè)符合要求的基因座(AC006989三個(gè)，AC0112895個(gè))。在這8個(gè)基因座兩端約200bp范圍內(nèi)設(shè)計(jì)引物，

7、用降溫(Touchdown)PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)銀染后判斷擴(kuò)增片段長度，確定是否有多態(tài)性。用e-PCR和BLAST等方法在GenBank、Genomedatabase和STRbase查找，確定基因座沒有被報(bào)道過。根據(jù)這兩個(gè)克隆在Y染色體上的位置，將這8個(gè)基因座定位于Yq11.221。把有關(guān)數(shù)據(jù)提交到Genomedatabase后，得到基因座名字。 3.新Y-STR的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及和黑猩猩同源序列對(duì)比、等位基因的命名。根據(jù)

8、國際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)推薦的命名原則來命名等位基因。為了使采用其它引物擴(kuò)增同一基因座時(shí)不改變等位基因的名字，把和黑猩猩同源序列相比沒有變化的重復(fù)模塊排除在外。 4.8個(gè)新Y-STR的等位基因和單倍型頻率在漢族人群體中的分布108個(gè)在漢族樣本中，DYS719發(fā)現(xiàn)了4個(gè)等位基因，基因多樣性為0.4954；DYS709有5個(gè)等位基因，基因多樣性為0.7039；DYS720發(fā)現(xiàn)了11個(gè)等位基因，基因多樣性0.8681，它由兩個(gè)高度可變的重復(fù)模

9、塊組成，使之有最高的基因多樣性。DYS718基因座有5個(gè)等位基因，基因多樣性為0.5554；DYS708基因座由5個(gè)等位基因，基因多樣性為0.7056；DYS721基因座有4個(gè)等位基因，基因多樣性為0.4563；DYS722基因座有5個(gè)等位基因，基因多樣性為0.6217；DYS723基因座有5個(gè)等位基因，基因多樣性為0.6271?；蚨鄻有院推骄貜?fù)次數(shù)的相關(guān)分析顯示在這兩者之間存在正相關(guān)(R=0.820，adjustedR2=0.62

10、0，F(xiàn)=12.432，P＜0.02)，提示不只是在一個(gè)基因座內(nèi)，在基因座之間也存在著重復(fù)次數(shù)越多，越容易產(chǎn)生突變，從而產(chǎn)生較高的基因多樣性這種傾向。 用這8個(gè)基因座進(jìn)行分析，在108個(gè)漢族個(gè)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)104種單倍型。其中100個(gè)單倍型為單一個(gè)體，另外4種單倍型分別有兩個(gè)個(gè)體。單倍型多樣性為0.9989±0.0002，即這8個(gè)基因座在法醫(yī)學(xué)上的親權(quán)否定概率和個(gè)人識(shí)別能力均為99.89％。主成分分析顯示各基因座之間相關(guān)性很小(最高相關(guān)

11、系數(shù)在DYS719和DYS720之間，相關(guān)系數(shù)-0.305，P＜0.001)，得到＞85％的信息需要6個(gè)主成分。 第二部分親權(quán)鑒定結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)的研究 1前言STR的應(yīng)用極大地提高了親權(quán)鑒定能力，甚至可以在單親(父親或者母親)和孩子之間進(jìn)行親權(quán)鑒定。對(duì)一個(gè)基因座在法醫(yī)學(xué)上應(yīng)用價(jià)值時(shí)，其中一個(gè)重要參數(shù)是非父排除概率(PE，powerofexclusion)，它是基于雙親均在的親權(quán)鑒定(簡稱雙親案親權(quán)鑒定)計(jì)算的，不適合于單親

12、案親權(quán)鑒定(既缺父或母的親權(quán)鑒定)。研究表明STR基因座的的突變率較高。在出現(xiàn)矛盾基因座時(shí)，如何對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，在國際法醫(yī)學(xué)界還沒有同一的認(rèn)識(shí)(包括單親和雙親親權(quán)鑒定)。運(yùn)用概率學(xué)理論，我們計(jì)算了單親否定概率，結(jié)合有關(guān)數(shù)據(jù)和我室多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，參考國外相關(guān)做法，對(duì)親權(quán)鑒定時(shí)出現(xiàn)矛盾基因座時(shí)檢驗(yàn)以及下結(jié)論的策略等問題作一探討。 2單親案親權(quán)否定概率PE1和單親鑒定時(shí)結(jié)果判定策略計(jì)算單親案親權(quán)否定概率時(shí)把孩子為純合子和雜合子分別考慮

13、。設(shè)Ai為一個(gè)基因座的等位基因，Pi為相應(yīng)的基因頻率，則在孩子為雜合子AiAj(概率為2PiPj)時(shí)，待排男子不含Ai也不含Aj時(shí)(機(jī)會(huì)為(1-Pi-Pj)2)被排除。同樣的道理，孩子為純合子AiAi(P2i)時(shí)，待排男子不含Ai(機(jī)會(huì)為(1-Pi)2)時(shí)被排除。各基因座的PE1均低于雙親案親權(quán)否定概率(平均0.575)。當(dāng)單親案親權(quán)鑒定出現(xiàn)0、1、2個(gè)矛盾基因座時(shí)，分別應(yīng)該檢測15、25、36個(gè)基因座才能下肯定的結(jié)論。如果出現(xiàn)兩個(gè)矛盾

14、基因座，而檢測基因座數(shù)量低于17個(gè)時(shí)，似然率小于0.042，傾向排除親權(quán)關(guān)系。 3雙親案親權(quán)鑒定所需基因座的數(shù)目及出現(xiàn)矛盾基因座時(shí)結(jié)果判定策略根據(jù)平均非父排除率和突變率，用二項(xiàng)分布公式分別計(jì)算雙親案親權(quán)鑒定在檢測9，13，15，17和24個(gè)基因座時(shí)，真父和隨機(jī)男出現(xiàn)0，1，2，3，4個(gè)矛盾基因座的概率和似然率。結(jié)果顯示如果沒有矛盾基因座出現(xiàn)，檢測9個(gè)基因座時(shí)似然率為2000，但是非父出現(xiàn)這種情況的概率在也有0.0005；出現(xiàn)1個(gè)

15、矛盾基因座，檢測17個(gè)STR基因座時(shí)，似然率為2.3×103。檢測24個(gè)STR基因座，真父和隨機(jī)男人出現(xiàn)2個(gè)，3個(gè)和4個(gè)矛盾基因座的似然比分別為1087，1.408和0.002。如果以似然率為1000(相當(dāng)于父權(quán)概率為99.90％)作為判定標(biāo)準(zhǔn)，建議親權(quán)鑒定中應(yīng)該檢測13個(gè)以上的STR基因座。出現(xiàn)1個(gè)和2個(gè)矛盾基因座時(shí)，應(yīng)該分別增加檢測到17和24個(gè)基因座，沒有新增矛盾基因座，才能下肯定的結(jié)論。檢測到3個(gè)矛盾基因座時(shí)，應(yīng)該用其它方法作進(jìn)

16、一步的分析。出現(xiàn)4個(gè)矛盾基因座時(shí)，可排除父權(quán)關(guān)系。 4.討論和傳統(tǒng)的基于蛋白和多糖的遺傳標(biāo)記相比，DNA遺傳標(biāo)記在親權(quán)關(guān)系鑒定中的應(yīng)用，極大地提高了親權(quán)鑒定能力，但是STR的突變率較高(0.02％到0.34％之間，平均0.17％)，在親權(quán)鑒定時(shí)，常會(huì)遇見矛盾基因座，因此出現(xiàn)少量矛盾基因座時(shí)，應(yīng)該如何下結(jié)論在國際法醫(yī)學(xué)界還沒有同一的認(rèn)識(shí)。由于在單親鑒定時(shí)失去了雙親一方的信息，因此應(yīng)該有不同的判定標(biāo)準(zhǔn)和策略。根據(jù)不同情況下的似然率，

17、我們建議在單親案親權(quán)鑒定時(shí)應(yīng)該檢驗(yàn)15個(gè)以上的基因座，以3個(gè)矛盾基因座為排除結(jié)論的界限。如果出現(xiàn)一個(gè)矛盾基因座，應(yīng)該檢測25個(gè)基因座，而出現(xiàn)2個(gè)矛盾基因座時(shí)應(yīng)該檢測36個(gè)以上的基因座。而雙親案親權(quán)鑒定，應(yīng)該檢測13個(gè)以上的基因座，以4個(gè)矛盾基因座為得出排除親權(quán)關(guān)系結(jié)論的界限。出現(xiàn)一個(gè)矛盾基因座時(shí)，應(yīng)該檢測17個(gè)以上的基因座，出現(xiàn)2個(gè)矛盾基因座時(shí)，應(yīng)該檢測24個(gè)以上的基因座。出現(xiàn)3個(gè)矛盾基因座時(shí)，應(yīng)該加做基因座或者用其它遺傳標(biāo)記進(jìn)一步檢驗(yàn)