1、目的:為了獲得高純度的眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素-4N(CTX-4N)，探索眼鏡蛇毒中細(xì)胞毒素-4N對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)的增殖抑制作用和CTX-4N通過(guò)ERK信號(hào)通路對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響，從而闡明CTX-4N通過(guò)ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　方法:采用DEAE-Sepha roseCL-6B陰離子交換柱、SpehadexG-50凝膠層析柱、Macro-prep High S陽(yáng)離子交換柱結(jié)合的方法對(duì)眼鏡蛇毒

2、蛋白進(jìn)行分離純化。采用HSC-T6增殖抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)每一步分離后的各峰蛋白CTX-4N進(jìn)行活性檢測(cè)。收集活性最強(qiáng)的蛋白峰，在用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定其純度。采用蛋白質(zhì)譜法鑒定其成分及分子量大小。用CCK-8方法檢測(cè)不同濃度的CTX-4N對(duì)HSC-T6的增殖抑制作用。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CTX-4N對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響。采用Western-Blot檢測(cè)CTX4-N作用HSC-T6細(xì)胞不同時(shí)間后，ERK信號(hào)通路中ERK1/2的磷酸化水平的

3、變化;以及在加入抑制劑PD98059處理HSC-T6細(xì)胞后，ERK信號(hào)通路中ERK1/2磷酸化水平的變化。抑制劑實(shí)驗(yàn)分組:空白對(duì)照組、CTX-4N組、抑制劑組和CTX-4N+抑制劑組。
　　結(jié)果:通過(guò)DEAE-SepharoseCL-6B陰離子交換柱、SpehadexG-50凝膠層析柱、Macro-prep HighS陽(yáng)離子交換柱分離純化后得到一個(gè)電泳純度的蛋白，蛋白質(zhì)譜鑒定為CTX-4N，分子量約為9.605 KDa。不同濃度的

4、CTX-4N對(duì)HSC-T6細(xì)胞具有增殖抑制作用，隨著濃度的增加而增強(qiáng)，最小抑制濃度為2μg/mL，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，IC50為(12.836±0.045)μg/mL。不同濃度的CTX-4N對(duì)HSC-T6細(xì)胞的凋亡作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，且誘導(dǎo)HSC-T6凋亡的最小濃度為4μg/mL。以4μg/mL的CTX-4N作用HSC-T6不同時(shí)間后，各時(shí)間點(diǎn)的ERK1/2蛋白表達(dá)沒(méi)有變化，而磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)一開(kāi)始是隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而

5、表達(dá)增加，作用10min后磷酸化ERK1/2表達(dá)水平最高，隨后就開(kāi)始降低，到60min后其表達(dá)低于對(duì)照組。以10μ mol/L的PD98059和4μg/mL的CTX-4N作用HSC-T6細(xì)胞后，ERK1/2蛋白的表達(dá)沒(méi)有發(fā)生改變，而可以顯著的抑制磷酸化ERK1/2的表達(dá)。
　　結(jié)論:廣西眼鏡蛇毒通過(guò)DEAE-SepharoseCL-6B陰離子交換柱、SpehadexG-50凝膠層析柱、Macro-prep High S陽(yáng)離子交換柱