1、肝纖維化(Hepatic fibrosis，HF)是肝臟對酒精、藥物、病毒感染、自身免疫失衡等細胞損傷因素而產(chǎn)生的一種可逆的愈合反應(yīng)，為慢性肝病共有的病理改變，主要表現(xiàn)為以膠原為主的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝內(nèi)大量沉積并伴有肝臟損傷，如果不加以控制，肝纖維化可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，嚴重威脅人類健康。探討肝纖維化形成過程中的機制對慢性肝病的治療具有重要的意義。
　　肝星狀細胞(Hepatic

2、stellate cells，HSCs)與肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程存在著密切的聯(lián)系，HSCs細胞的激活對肝纖維化的形成有著重要的作用。激活的HSCs細胞轉(zhuǎn)化形為肌成纖維細胞(Myofibroblast-like cells，MFBLC)，并分泌大量的膠原，最終導致肝纖維的形成。作為肝纖維化發(fā)生的主要效應(yīng)細胞之一，促進增殖的HSCs發(fā)生凋亡已成為防治肝纖維化有效途徑。大量研究證實，自噬(Autophagy)在肝纖維化形成過程中發(fā)揮著重要的作用

3、，自噬與HSCs細胞的凋亡也存在密切的聯(lián)系。同時，研究表明，HSCs細胞的激活能夠促進細胞鈣離子(Ca2+)內(nèi)流，抑制HSCs細胞Ca2+內(nèi)流對促進活化的HSCs細胞發(fā)生凋亡具有重要的意義。并且，研究證實Ca2+濃度的變化對細胞自噬也起著重要的調(diào)節(jié)作用。課題組前期研究證實，非選擇性Ca2+瞬時感受器電位離子通道香草素受體亞家族4(Transient receptor potential vanilloid receptor4，TRPV4

4、)在肝纖維化形成中發(fā)揮著重要的作用。本課題重點研究TRPV4對大鼠HSC-T6的作用，為肝纖維化的治療提供新的靶點。
　　主要研究內(nèi)容概括如下：
　　1. TRPV4在大鼠肝星狀細胞中的表達情況及對大鼠肝星狀細胞凋亡蛋白的影響
　　實驗采用大鼠HSC-T6細胞系為研究對象，用濃度為10ng/ml TGF-β1處理細胞24h，實時定量PCR(qRT-PCR)、Western blot檢測TRPV4的mRNA和蛋白的表達水

5、平，檢測結(jié)果顯示，與未處理組相比，TGF-β1處理后，TRPV4的 mRNA和蛋白水平明顯升高。提示TRPV4在大鼠HSC-T6細胞中增殖、活化過程中可能發(fā)揮著重要的作用。采用LipofectamineTM2000介導的siRNA技術(shù)特異性沉默大鼠HSC-T6細胞內(nèi)TRPV4，首先通過流式細胞技術(shù)觀察大鼠HSC-T6細胞凋亡情況，并采用qRT-PCR、Western blot檢測 Bax、Caspase3 mRNA水平以及 Bax、pr

6、o-caspase3蛋白水平。qRT-PCR、Western blot結(jié)果顯示，與TGF-β1處理組相比，特異性阻斷TRPV4的表達，可明顯提高 Bax、Caspase3 mRNA水平以及Bax、pro-caspase3蛋白水平。流式結(jié)果顯示，與TGF-β1處理組相比，特異性阻斷TRPV4的表達，可明顯促進大鼠HSC-T6細胞凋亡蛋白的表達。與之相應(yīng)的，通過TRPV4的特異性激動劑1uM4α-PDD激活TRPV4，qRT-PCR、Wes

7、tern blot檢測結(jié)果顯示，與TGF-β1處理組相比，Bax、Caspase3 mRNA水平以及Bax、pro-caspase3蛋白水平明顯下降。提示，在細胞活化的過程中，TRPV4可以抑制凋亡蛋白的表達，可能起到調(diào)控細胞凋亡的作用。
　　2.自噬在大鼠HSC-T6細胞中的水平及TRPV4對自噬水平的影響機制研究
　　qRT-PCR、Western blot檢測顯示，與未處理組相比，TGF-?1處理后，LC3的mRNA和

8、蛋白水平明顯升高，P62的mRNA和蛋白水平明顯降低。特異性阻斷TRPV4，qRT-PCR、Western blot檢測結(jié)果顯示，與TGF-?1處理組相比，LC3的mRNA和蛋白水平明顯降低，P62的mRNA和蛋白水平明顯升高，吖啶橙染色結(jié)果顯示，自噬小泡明顯減少。激活TRPV4后，qRT-PCR、Western blot檢測結(jié)果顯示，與TGF-?1處理組相比，LC3的mRNA和蛋白水平明顯升高，P62的mRNA和蛋白水平明顯降低，吖啶

9、橙染色結(jié)果顯示，自噬小泡明顯減少。為了進一步研究TRPV4對自噬的調(diào)節(jié)機制，大量文獻證實，AKT通路是自噬的經(jīng)典上游通路。通過特異性阻斷TRPV4，Western blot檢測結(jié)果顯示，與TGF-?1處理組相比，p-AKT蛋白表達水平明顯降低。以上結(jié)果提示，在細胞活化的過程中，TRPV4可能是通過激活A(yù)KT通路繼而上調(diào)自噬。
　　3.在大鼠HSC-T6細胞中自噬對凋亡蛋白表達的影響
　　使用自噬抑制劑氯喹抑制自噬的水平，qR

10、T-PCR、Western blot檢測結(jié)果顯示，與TGF-?1處理組相比，Bax、Caspase3 mRNA水平以及Bax、pro-caspase3蛋白水平明顯升高。提示在大鼠HSC-T6細胞中，抑制自噬水平可明顯促進凋亡蛋白的表達。為了進一步探討TRPV4與自噬和凋亡蛋白變化之間的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，在抑制自噬的基礎(chǔ)上激活TRPV4，與TRPV4不處理組比較，凋亡蛋白沒有明顯的變化。證實TRPV4可能是通過激活自噬進而抑制凋亡凋亡蛋白的