1、目的：研究成人脂肪基質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過程中Bcl-2/Bax調(diào)控蛋白與線粒體凋亡通路的關(guān)系，從而為進(jìn)一步增加獲得的ADSCs源性神經(jīng)元數(shù)量并延長其存活時間提供科學(xué)的指導(dǎo)方法。
　　方法：1參照葉長青等的實(shí)驗方法，將所取的成人脂肪組織體外分離、培養(yǎng)為ADSCs，倒置相差顯微鏡下每日觀察 ADSCs的形態(tài)學(xué)變化。2將傳至第2、3代的生長狀態(tài)良好的ADSCs，應(yīng)用以含β-巰基乙醇為主要成分的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化，按照誘導(dǎo)

2、時間長短的不同將細(xì)胞分為未誘導(dǎo)組、預(yù)誘導(dǎo)組及誘導(dǎo)1h、3h、5h、8 h組，并在倒置相差顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。3應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western-blotting法分別檢測未誘導(dǎo)的ADSCs及預(yù)誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)分化1h、3h、5h、8h組的神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neurons specific enolase，NSE），Bcl-2蛋白家族蛋白 Bcl-2、Bax，半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-9（Cysteine asp

3、artate specific protease-9，Caspase-9），細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cyt-c）及半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（Cysteine aspartate specific protease-3，Caspase-3）的表達(dá)情況。4透射電子顯微鏡下觀察誘導(dǎo)反應(yīng)過程中細(xì)胞和線粒體超微結(jié)構(gòu)變化的特點(diǎn)。5應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡測定線粒體的熒光強(qiáng)度來反應(yīng)線粒體膜電位值及其通透性。6應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù) Anne

4、xin/PI雙染法檢測未誘導(dǎo)的ADSCs及預(yù)誘導(dǎo)、誘導(dǎo)分化1h、3h、5 h、8 h時細(xì)胞的生存狀態(tài)。7統(tǒng)計學(xué)方法：所得實(shí)驗數(shù)據(jù)應(yīng)用Exce l2003數(shù)據(jù)庫整理，所得數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，采用單因素方差分析對不同時間點(diǎn)間的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：在預(yù)誘導(dǎo)組及誘導(dǎo)第1h、3h、5h、8h組均可見 NSE的陽性表達(dá)，在誘導(dǎo)第5h時NS

5、E的陽性表達(dá)率（83.60±3.20％）進(jìn)入高峰期（P＜0.05），誘導(dǎo)第8h時NSE的表達(dá)與5h時無明顯差異（P＞0.05）。隨著誘導(dǎo)反應(yīng)時間延長，Bc l-2的表達(dá)水平明顯逐漸降低，且以未誘導(dǎo)組最高（P＜0.05）；而 Bax、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)水平則明顯逐漸升高，誘導(dǎo)至8h時達(dá)到高峰值（P＜0.05）。4應(yīng)用Western-blotting法在未誘導(dǎo)組ADSCs檢測到NSE的弱陽性表達(dá)，在預(yù)誘

6、導(dǎo)組及誘導(dǎo)第1h、3h、5h、8h組均可見 NSE的陽性表達(dá)，在誘導(dǎo)第5h時 NSE的表達(dá)水平已經(jīng)進(jìn)入高峰期（P＜0.05），誘導(dǎo)第8h時NSE的表達(dá)與5h時無明顯差異（P＞0.05）。隨著誘導(dǎo)反應(yīng)時間的延長，Bc l-2的表達(dá)水平明顯逐漸降低，且未誘導(dǎo)組最高（P＜0.05）；而 Bax、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)水平均逐漸升高，誘導(dǎo)至8h時達(dá)到高峰（P＜0.05）。5透射電子顯微鏡下觀察到誘導(dǎo)5h時的凋亡

7、細(xì)胞具有細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)邊集和線粒體腫脹、空泡化等超微結(jié)構(gòu)變化特征。6激光共聚焦顯微鏡的檢測結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時間的延長，線粒體熒光強(qiáng)度逐漸減弱（P＜0.05）。7流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果顯示，誘導(dǎo)反應(yīng)過程中的細(xì)胞存活率隨著誘導(dǎo)時間的延長逐漸下降，早期凋亡率、晚期凋亡或壞死率隨著誘導(dǎo)時間的延長而逐漸升高。
　　結(jié)論：在 ADSCs體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元的過程中，反應(yīng)至第5h時 ADSCs已經(jīng)分化成了典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞，而且在誘導(dǎo)反應(yīng)第