1、麻瘋樹(Jatropha CHrcas)為大戟科麻瘋樹屬植物，其種仁中富含蛋白質(zhì)。本實驗室從麻瘋樹種仁中分離得到的麻瘋樹毒蛋白(curcin)已被證明是一種I型核糖體失活蛋白，該蛋白作為植物抗真菌蛋白中的一類，在體外對多種植物病原真菌具有強(qiáng)烈抑制作用。 水稻作為我國最重要的糧食作物，真菌病害每年都會對水稻造成不同程度的減產(chǎn)。因此，利用植物基因工程技術(shù)，將麻瘋樹毒蛋白基因?qū)胨究赏岣咚緦Σ≡婢牡挚鼓芰?，對水稻的抗病育種是

2、一個有效的途徑。 本研究構(gòu)建麻瘋樹毒蛋白基因的植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻，獲得了有價值的轉(zhuǎn)基因植株，同時，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化，為curcin基因的深入研究和應(yīng)用于植物抗真菌基因工程奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1．根據(jù)麻瘋樹毒蛋白curcin的cDNA序列設(shè)計引物，從麻瘋樹基因組中成功分離到編碼curcin的開放閱讀框(ORF)，此片段長約930bp，為下一步植物表達(dá)載體的構(gòu)建奠定了基

3、礎(chǔ)。 2．得到的curcin基因片段被定向克隆到植物雙元表達(dá)載體pBll21質(zhì)粒，構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體pBll21-curcin，同時構(gòu)建了一個中間克隆載體pMDl8-T-curcin。其中，中間克隆載體含有curcin基因和用于轉(zhuǎn)化子篩選的lacZ基因；而植物表達(dá)載體pBll21-curcin，含有CaMV35S啟動子調(diào)控的curcin基因，選擇標(biāo)記為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptII)基因。 3．以粳稻(Japort

4、ica)品種日本晴與中花11號為材料，對影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻轉(zhuǎn)化體系的幾個因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，NB培養(yǎng)基適用于中花11號愈傷組織的誘導(dǎo)，MS培養(yǎng)基適用于日本晴愈傷組織的誘導(dǎo)，而添加1.5 mg/LABA會延長粳稻出愈時間；國內(nèi)首次使用了100μg/ml嘌呤合成抑制劑acivicin在轉(zhuǎn)化前對愈傷組織進(jìn)行預(yù)處理，此法可有效提高GUS基因的瞬時表達(dá)率；在轉(zhuǎn)化過程中，愈傷組織在農(nóng)桿菌菌液中浸染時間以10-15min最佳，而其與農(nóng)桿菌最佳共

5、培養(yǎng)時間為4d；在抗性愈傷組織的篩選中，選用了較為經(jīng)濟(jì)的Cefazolin做為抑菌劑，其最適使用濃度為200-300mg/L；實驗采用G418作為篩選試劑，通過設(shè)置不同的G418濃度及對照，觀測侵染后的愈傷組織和對照的愈傷組織增重率，來確定最適篩選濃度為50-100mg/L：在分化過程中，采用6-BA 2.0mg/L＋NAA 0.2mg/L的激素配比，有利于分化率的提高。 4．應(yīng)用上述轉(zhuǎn)化體系，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化curcin基