1、一、背景和目的：
　　 在肝膽外科臨床中，膽管梗阻、膽汁淤積是常見的病理環(huán)境，較長時間梗阻，可誘發(fā)永久性肝損害，甚至發(fā)展成肝纖維化及肝硬化，是臨床治療的難題，相關發(fā)病機制基礎研究有現(xiàn)實意義。
　　 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類慢性肝病組織如肝硬化、亞急性肝壞死后肝再生、兒童先天性肝外膽管閉鎖、遺傳性血色病、慢性病毒性肝炎、原發(fā)性肝癌中都存在類似于卵圓細胞的肝前體細胞。這種肝前體細胞定位于匯管區(qū)、纖維間隔、匯管區(qū)旁肝實質、假小葉及炎癥邊界

2、。隨著肝臟卵圓細胞特異性標記物的發(fā)現(xiàn)，卵圓細胞相關研究成為熱點，特別是肝臟卵圓細胞參與肝臟損傷修復、肝臟纖維化的相關研究。另外有研究證明多種組織器官的纖維化進程中伴隨著胚胎發(fā)育相關基因及多種細胞因子的重新激活。這些為研究肝臟損傷的保護、治療及肝纖維化的形成機制提供了最新途徑。
　　 因此，本研究通過結扎Wistar大鼠膽總管，模擬膽管梗阻病理狀態(tài)，通過免疫組化、PCR技術，探討這一病理過程相關細胞因子和肝臟卵圓細胞在膽管梗阻肝臟

3、纖維化過程中發(fā)揮的作用。
　　 二、材料與方法：
　　 雄性Wistar大鼠60只，體重250-300克，健康，無明顯畸形，將動物隨機分成兩組，一組(30只)作為實驗組實施近肝門端膽總管單線結扎(BDL術)；另一組(30只)作為對照組實施假手術，開腹游離膽總管但不結扎。術后相同條件下飼養(yǎng)。分別于術后第1天、2天、3天、7天、14天、21天處死大鼠，每組各處死5只，取肝右葉應用4％多聚甲醛固定，留作免疫組化；取肝左葉-80

4、℃凍存，留作RT-PCR檢測。
　　 1、通過肉眼及HE染色觀察膽管梗阻不同時間點肝臟形態(tài)改變。
　　 2、通過免疫組化，OV-6標記卵圓細胞，觀察不同時間點卵圓細胞的數目、分布。
　　 3、通過PCR檢測各目的基因：轉化生長因子(TGF-β1、TGF-α)，肝細胞生長因子(HGF)，膠原蛋白Ⅰ(COLⅠ)，觀察不同時間點各基因的表達情況。
　　 三、結果：
　　 1、大體結果
　　 Wi

5、star大鼠膽管梗阻后可見肝臟黃染并腫脹，肝臟淤血、水腫。福爾馬林固定后部分大鼠的肝葉標本，可見表面粗糙，顏色灰白等肝組織早期肝纖維化的表現(xiàn)。對照組：肝臟標本各肝葉色澤紅潤，表面光滑。
　　 2、HE染色結果：
　　 術后第1天見少量嗜中性粒細胞和淋巴細胞浸潤；術后第2天少許新增生無管腔的小膽管，少量嗜中性粒細胞和淋巴細胞浸潤；術后第3天新增生的細小膽管和無管腔的小膽管，嗜中性粒細胞和淋巴細胞浸潤較術后第2天明顯增加，肝

6、細胞輕度變性，可見灶狀和片狀壞死，肝組織匯管區(qū)可見膽管增生和纖維組織細胞增生，偶見膽管擴張；術后第7天肝細胞出現(xiàn)變性壞死發(fā)生率增加及程度加重，重者見片狀出血和壞死，肝組織門區(qū)可見膽管增生和纖維細胞增生；術后14天小葉結構受到破壞，可見肝細胞空泡變性及壞死；術后21天小葉結構破壞更加嚴重，大量肝細胞壞死。隨時間進展肝臟損傷、纖維化程度逐漸加重。
　　 3、免疫組化結果
　　 OV-6免疫組化陽性染色的細胞數目及分布范圍隨著

7、梗阻時間的延長而增加，實驗組和對照組有明顯差異。OV-6陽性細胞表達部位主要位于匯管區(qū)膽管及肝間質新增生膽管及無管腔的小膽管細胞胞漿中。
　　 4、RT-PCR結果
　　 在對照組和BDL組大鼠肝臟中均能檢測出目的基因的表達。統(tǒng)計分析顯示兩組TGF-β1、COLⅠ的表達差異從第1天開始有統(tǒng)計學意義，BDL組與對照組中HGF及TGF-α的表達差異從第3天開始有統(tǒng)計學意義。對BDL不同天數組間的表達研究發(fā)現(xiàn)COLⅠ、TGF-

8、β1在3-7天無統(tǒng)計學意義，HGF在1-3天、7-21天，TGF-α在1-2、7-21天無統(tǒng)計學意義，而其他相鄰各組間均有統(tǒng)計學意義，COLⅠ、TGF-β1指標1-3天增長趨勢最明顯，TGF-α、HGF指標3-7天增長趨勢最明顯。
　　 四、結論：
　　 1、研究發(fā)現(xiàn)肝外膽管結扎造成膽管梗阻的大鼠模型，其肝臟呈現(xiàn)膽汁淤積性、進行性加重的纖維化表現(xiàn)。卵圓細胞參與膽管梗阻后損傷的修復過程，其時序性變化趨勢與抗肝臟纖維化的細胞

9、因子變化趨勢相似，可能參與抗纖維化過程。
　　 2、研究發(fā)現(xiàn)實驗組肝臟纖維化相關基因表達明顯高于對照組，并且隨著梗阻天數的增加表達量增加，其中COLⅠ可顯示纖維化的進程，TGF-β1與促進肝臟纖維化過程有關，TGF-α、HGF與對抗肝臟纖維化過程有關。
　　 3、研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化過程中的3-7天是纖維化過程的特殊時期，第3天之前以促纖維化過程為主要表現(xiàn)；第3天開始出現(xiàn)抗纖維化表現(xiàn)，促纖維化趨勢減弱，纖維化速度減慢；第7