1、本文主要從以下幾個(gè)部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體干細(xì)胞歸巢示蹤研究
　　目的:
　　間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多能干細(xì)胞，具有體內(nèi)組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞具有治療炎癥性腸病的重要潛在應(yīng)用價(jià)值。間充質(zhì)干細(xì)胞的移植后在受者體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸受到干細(xì)胞來源、移植方式、受者免疫狀體、移植次數(shù)等多方面因素的影響，具有顯著的個(gè)體差異。然而目前尚沒有一種可行的方法個(gè)體化地評(píng)估輸注到體內(nèi)的間充質(zhì)干

2、細(xì)胞向腸粘膜歸巢效率。傳統(tǒng)的影像學(xué)示蹤方法難以有效地區(qū)分死細(xì)胞殘片和存活的間充質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)也難以評(píng)估干細(xì)胞向腸粘膜的歸巢效率。共聚焦激光顯微內(nèi)窺鏡是近年來發(fā)明的一種新型內(nèi)鏡，能夠在體內(nèi)無創(chuàng)、實(shí)時(shí)地顯示組織形態(tài)，放大倍率可達(dá)1000倍，并具有細(xì)胞水平的分辨率。共聚焦激光顯微內(nèi)窺鏡所采用的激發(fā)波長為488 nm，接波長為505～585 nm，同增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的光學(xué)特性相匹配。本研究中我們提出使用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡有可能在活體內(nèi)以細(xì)胞水

3、平的分辨率無創(chuàng)地示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞向腸粘膜歸巢。
　　方法:
　　從Sprague-Dawley大鼠體內(nèi)分離、鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分別使用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白和活體染料羧基熒光素乙酰乙酸(CFSE)標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，使用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體外對(duì)標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞成像。進(jìn)一步將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(eGFP-MSC)通過靜脈注射或者腹腔注射途徑輸注到DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠模型體內(nèi)，并使用共聚焦激光顯

4、微內(nèi)鏡進(jìn)行活體成像。所獲得的圖像同對(duì)組織切片進(jìn)行免疫熒光、免疫組化和熒光免疫原位雜交得到的圖像進(jìn)行對(duì)比。明確向結(jié)腸粘膜歸巢的eGFP-MSC在共聚焦激光顯微內(nèi)鏡下的形態(tài)特征。進(jìn)一步比較不同條件下eGFP-MSC向大鼠結(jié)腸炎癥粘膜的歸巢效率，分別以四種不同條件構(gòu)建移植模型1）大鼠-大鼠干細(xì)胞同種異體移植，2）人-大鼠干細(xì)胞異種移植，3）低氧處理大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞后同種異體移植，4）受體大鼠經(jīng)白消安免疫抑制處理后移植同種異體干細(xì)胞。四種條件下

5、移植后均同法進(jìn)行共聚焦激光顯微內(nèi)鏡成像，示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞。編寫自動(dòng)化圖像識(shí)別程序，自動(dòng)識(shí)別圖像干細(xì)胞并計(jì)算頻率。
　　結(jié)果:
　　通過密度梯度離心法從供體大鼠骨髓中成功分離了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，所得細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下能成功分化為骨組織、脂肪組織和軟骨組織。間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞鑒定表達(dá)CD29(+)，CD44(+)，CD73(+)和CD90(+)，不表達(dá)CD34（-），CD45（-）和CD11b/c（-）。上述表型符合大鼠間充質(zhì)

6、干細(xì)胞定義。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡能夠在體外清晰地看到增強(qiáng)型綠色熒光蛋白或活體染料CFSE標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外成像同熒光顯微鏡觀察特征接近。使用FIVE1共聚焦內(nèi)鏡系統(tǒng)能夠在大鼠活體腸粘膜上無創(chuàng)性地觀察到eGFP-MSC，其特征為明亮的、圓形并帶有內(nèi)部異質(zhì)性的細(xì)胞核。免疫熒光、免疫組化和熒光免疫原位雜交均證實(shí)受體大鼠腸粘膜上存在eGFP陽性的細(xì)胞。在大鼠-大鼠同種異體移植、人-大鼠異種移植、低氧誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞和白消安免疫抑制受體大鼠

7、四種不同條件干細(xì)胞移植模型中，活體共聚焦激光顯微內(nèi)鏡能夠顯示移植后向受體大鼠腸粘膜歸巢的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量，并通過自動(dòng)圖像處理程序計(jì)數(shù)。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡定量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)低氧誘導(dǎo)后，eGFP-MSC向炎癥腸粘膜的效率有增加趨勢(shì)(低氧誘導(dǎo)組114.1 vs其他組合并34.3，t=2.14，P=0.0644)。
　　結(jié)論:
　　共聚焦激光顯微內(nèi)鏡是一種能夠在活體內(nèi)示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞移植后向腸粘膜歸巢的新型工具，具有良好的應(yīng)用前景。這種臨

8、床可用的無創(chuàng)性的細(xì)胞水平示蹤技術(shù)能夠?yàn)榛颊邆€(gè)體化的干細(xì)胞治療提供依據(jù)。
　　意義:
　　本研究是世界上首次使用內(nèi)鏡設(shè)備對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)示蹤，而且具有細(xì)胞水平分辨率。對(duì)比先前的影像學(xué)示蹤方法，共聚焦激光顯微內(nèi)鏡不會(huì)受到死細(xì)胞碎片的影響，只有活的完整細(xì)胞能夠顯像，在消化道粘膜對(duì)干細(xì)胞示蹤具有明顯的優(yōu)越性。
　　第二部分 共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體評(píng)估結(jié)腸粘膜生理功能與粘膜菌群相關(guān)性研究
　　目的:
　　人類腸道中寄

9、居著數(shù)量龐大的微生物群體。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人類腸道菌群的組成逐漸被人們認(rèn)識(shí)。人類腸道菌群在人類健康的維持中起了至關(guān)重要的作用，但在結(jié)直腸粘膜上，腸道菌群如何同宿主相互作用仍不清楚。有研究報(bào)道，結(jié)直腸菌群受到宿主腸道生理狀態(tài)的影響，例如腸道氧氣分壓顯著影響腸道菌群能量代謝。腸道菌群很可能同時(shí)受到多種宿主生理狀態(tài)的影響，然而先前研究中從未將腸道的多項(xiàng)生理功能同粘膜菌群同時(shí)進(jìn)行分析研究。這可能是受限于臨床可行性，同時(shí)檢測(cè)多項(xiàng)

10、指標(biāo)需要從同一受試者身上取得相應(yīng)數(shù)量的標(biāo)本，對(duì)受試者造成創(chuàng)傷。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡是近年來進(jìn)入臨床應(yīng)用的一種新型內(nèi)鏡設(shè)備，可以在受試者消化道內(nèi)進(jìn)行無創(chuàng)性的成像，在提供實(shí)時(shí)組織圖像的同時(shí)，反應(yīng)結(jié)直腸粘膜的多項(xiàng)生理功能。本課題中，我們創(chuàng)新性地提出了共聚焦激光顯微內(nèi)鏡能夠通過顯示宿主腸粘膜的在體生理狀態(tài)來分析宿主與腸道菌群的相互作用關(guān)系。這有助于闡明宿主-腸道菌群相互作用規(guī)律。
　　方法:
　　自2013年11月至2014年4月，在

11、山東大學(xué)齊魯醫(yī)院召集受試者參與此項(xiàng)研究。符合納入條件的受試者常規(guī)進(jìn)行共聚焦激光顯微結(jié)腸鏡檢查。檢查過程中先進(jìn)行白光內(nèi)鏡篩查，對(duì)病變部位和臨近的正常對(duì)照部位使用探頭式共聚焦激光顯微內(nèi)鏡檢查。利用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡評(píng)估受試者結(jié)直腸粘膜上皮的生理狀態(tài)，對(duì)結(jié)腸粘膜形態(tài)和生理功能的9個(gè)特征進(jìn)行評(píng)估，分別為杯狀細(xì)胞密度、隱窩擴(kuò)大、星狀隱窩、長管狀隱窩、上皮滲漏熒光素、上皮變厚、隱窩內(nèi)有熒光素、熒光素漏出血管、浸潤的細(xì)胞群。對(duì)所檢查部位的粘膜活檢，通

12、過16s rDNA焦磷酸測(cè)序的方法檢測(cè)腸粘膜菌群組成。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理得出每個(gè)樣本中各物種的含量，通過微生物多樣性分析、聚類分析、主坐標(biāo)分析與非冗余分析和LEfSe分析闡明腸道菌群組成及其同活檢部位、疾病狀態(tài)的關(guān)系，利用網(wǎng)絡(luò)分析分析結(jié)直腸粘膜菌群同結(jié)直腸粘膜形態(tài)和生理狀態(tài)間的相關(guān)關(guān)系。利用PICRUSt算法預(yù)測(cè)菌群的宏基因組，同法利用網(wǎng)絡(luò)分析分析腸粘膜生理狀態(tài)同菌群的宏基因組功能通路間的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　本研究

13、共篩查267名受試者，其中的39名患者進(jìn)入最終數(shù)據(jù)分析。所獲得的樣本共有結(jié)腸腺瘤病變25處，潰瘍性結(jié)腸炎病變5處，內(nèi)鏡下正常病變39處。粘膜菌群高通量測(cè)序的結(jié)果經(jīng)過降噪、去除低質(zhì)量序列和嵌合體等預(yù)處理步驟，共獲得554，070條優(yōu)質(zhì)序列。不同病變類型間腸粘膜菌群生物多樣性無明顯不同。腺瘤組的組內(nèi)距離和不同組的組間距離顯著高于正常粘膜的組內(nèi)距離（兩者均p＜0.05）。人類腸粘膜菌群聚集為三個(gè)主要的聚類，分別由普氏菌、擬桿菌和乳酸球菌主導(dǎo)。

14、粘膜菌群的聚類同活檢部位和疾病狀態(tài)間并無顯著的相關(guān)性，但菌群與其棲息的粘膜生理狀態(tài)間存在密切的關(guān)系，后者可以通過共聚焦激光顯微內(nèi)鏡無創(chuàng)性地在體觀察。網(wǎng)絡(luò)分析顯示結(jié)直腸粘膜菌群可以分為兩個(gè)亞網(wǎng)絡(luò)與相對(duì)孤立的梭桿菌，亞網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部成員細(xì)菌間只存在正相關(guān)關(guān)系，不同亞網(wǎng)絡(luò)的成員細(xì)菌之間只存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。粘膜炎癥改變粘膜菌群中兩個(gè)亞網(wǎng)絡(luò)的平衡關(guān)系。梭桿菌同粘膜生理功能之間存在最密切的關(guān)系，而同其他粘膜細(xì)菌間沒有相關(guān)性。炎癥細(xì)胞浸潤同粘膜宏基因組中多個(gè)

15、組分存在相關(guān)關(guān)系，其中包括Ⅳ型分泌系統(tǒng)的VirD2成分。
　　結(jié)論:
　　本課題發(fā)現(xiàn)腸粘膜菌群同腸粘膜生理狀態(tài)之間存在密切的相關(guān)關(guān)系。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡是一種臨床可用的檢查工具，可以在體內(nèi)用來研究腸粘膜生理狀態(tài)同腸粘膜菌群之間的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。
　　意義:
　　本研究是世界上首次將內(nèi)鏡設(shè)備應(yīng)用于腸道菌群研究，為宿主-菌群關(guān)系研究提供了一種全新的、臨床可行的研究方法。本研究所發(fā)現(xiàn)的粘膜菌群宏基因組同粘膜生理功能之間的相關(guān)