1、目的：研究癌相關(guān)成纖維細胞（CAF）對乳腺癌細胞遷移功能的影響及其分子機制。
　　方法：采用生物信息學手段分析課題組前期 MCF-10A/Twist和MCF-10A/Vector細胞的mRNA與蛋白芯片數(shù)據(jù)，研究整合素家族的表達情況。運用qRT-PCR法檢測ITGB3基因在正常乳腺組織、原位導管癌、浸潤性乳腺癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌臨床樣本中的表達。利用 qRT-PCR和western blot的方法篩選內(nèi)源性高表達ITGB3基因的乳腺癌

2、細胞系。將ITGB3-shRNA包裝到慢病毒中，構(gòu)建穩(wěn)定干擾ITGB3基因表達的BT549、Hs578T細胞模型，并利用qRT-PCR和western blot驗證ITGB3的表達。Transwell法檢測ITBG3穩(wěn)定干擾細胞模型的遷移能力的改變。將穩(wěn)定干擾ITGB3的細胞分別與NF、CAF進行共培養(yǎng)，Transwell法和劃痕實驗檢測其遷移能力的改變。在MCF-7和SK-BR-3細胞中過表達ITGB3，采用western blot進

3、行驗證。將過表達ITGB3基因的細胞與NF、CAF進行共培養(yǎng)，Transwell法檢測其遷移能力的改變。分析前期NF與 CAF mRNA芯片數(shù)據(jù)，篩選出其中差表達的分泌因子，并用qRT-PCR和 ELISA驗證芯片結(jié)果。用Kaplan-meier法分析分泌因子CCL18的表達與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。qRT-PCR檢測從臨床乳腺癌樣本中分離出的NF及CAF中CCL18的表達情況。CO-IP檢測CCL18與ITGB3相互作用的情況。利用siRN

4、A干擾CAF中CCL18的表達，采用qRT-PCR、western blot和ELISA法進行驗證。干擾CCL18的CAF與干擾ITGB3的細胞模型進行共培養(yǎng)，Transwell法檢測細胞遷移能力的變化。在 CAF的無血清條件培養(yǎng)基中加入 CCL18的中和抗體，再與穩(wěn)定干擾ITGB3的細胞共培養(yǎng)，Transwell檢測細胞遷移能力的改變。將分泌因子CCL18直接與ITGB3干擾細胞模型共培養(yǎng)，Transwell法檢測細胞遷移能力的變化。

5、利用western blot檢測CCL18作用于ITGB3后所激活的下游信號通路和遷移相關(guān)蛋白E-cadherin及Vimentin的表達。CCL18作用于BT549細胞，同時抑制下游信號通路p38/MAPK的活化，Transwell檢測細胞遷移能力的變化，western blot檢測E-cadherin及Vimentin的表達情況。
　　結(jié)果：整合素家族在MCF-10A/Twist細胞中表達異常，ITGB3基因在乳腺癌臨床樣本中

6、的表達水平隨著腫瘤惡性程度的增加而升高。BT549、Hs578T是內(nèi)源性高表達ITGB3的細胞系，MCF-7、SK-BR-3是低表達ITGB3的細胞系。成功構(gòu)建ITGB3穩(wěn)定干擾的BT549、Hs578T細胞模型和ITGB3過表達的MCF-7、SK-BR-3細胞模型。CAF能夠促進ITGB3陽性表達的乳腺癌細胞遷移，但NF無該現(xiàn)象。CAF異常高表達的分泌因子CCL18,其表達水平與乳腺癌的不良預(yù)后成正相關(guān)。臨床樣本顯示CAF中CCL18

7、的表達水平明顯高于NF并且CCL18能夠與ITGB3發(fā)生相互作用。CAF中干擾CCL18表達或者CAF條件培養(yǎng)基中加入CCL18中和抗體后，CAF促ITGB3陽性表達細胞的遷移能力降低。ITGB3陽性表達的細胞中加入CCL18，細胞的遷移能力上調(diào)。CCL18作用于 ITGB3后激活下游 p38/MAPK信號通路，并且抑制E-cadherin表達，促進Vimentin表達。
　　結(jié)論：CAF能夠產(chǎn)生分泌因子CCL18，CCL18能夠