1、第一部分：
　　 靶向PTEN的shRNA真核表達載體的構(gòu)建和鑒定
　　 目的：構(gòu)建靶向PTEN基因的短發(fā)卡RNA（shRNA）表達載體，并探討該表達載體對目的基因PTEN的沉默效果。
　　 方法：設(shè)計兩條PTEN特異性shRNA編碼序列和一條非特異性陰性對照序列，插入質(zhì)粒pSilencer 2.1-U6 hygro中，進行雙酶切和測序鑒定。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細胞系HELF細胞,同時以陰性

2、對照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染試劑對照和無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染HELF細胞分別作為陰性對照，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對照和空白對照,采用RT-PCR技術(shù)及蛋白免疫印跡法（Western Blotting）檢測PTEN在mRNA水平及蛋白水平的表達變化.
　　 結(jié)果：測序結(jié)果和酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測證實成功構(gòu)建了PTEN的shRNA真核表達載體。RT-PCR及Western Blotting結(jié)果顯示：兩條含有PTEN shRNA的質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染入HELF細胞后在mRNA

3、水平及蛋白水平均能明顯的抑制PTEN的表達，其中以第二條即shRNA-PTEN2抑制效果最為明顯。
　　 結(jié)論：成功的構(gòu)建了PTEN特異性shRNA真核表達載體,經(jīng)鑒定其在成纖維細胞中具有干擾PTEN基因表達的功能，為進一步研究成纖維細胞中的PTEN基因表達在腫瘤形成和發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：
　　 攜帶PTEN shRNA質(zhì)粒的HELF對乳腺癌細胞系MDA-MB-231生物學(xué)特性的影響

4、　　 目的：探討PTEN基因表達受抑的成纖維細胞(HELFPTEN-)與乳腺癌細胞MDA-MB-231共培養(yǎng)時，乳腺癌細胞在增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移上的生物學(xué)變化，揭示腫瘤微環(huán)境對腫瘤生物學(xué)特性影響的部分機制。
　　 方法：將HELFPTEN-與乳腺癌細胞系MDA-MB-231共培養(yǎng)。（1）通過流式細胞儀對MDA-MB-231細胞進行Ki67檢測，檢測共培養(yǎng)體系對MDA-MB-231細胞增殖能力的影響；（2）5-FU誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，

5、通過Annexin V/PI流式細胞儀檢測共培養(yǎng)體系對MDA-MB-231細胞抗凋亡能力的影響；（3）通過明膠酶譜實驗驗證共培養(yǎng)體系的培養(yǎng)基中MMP蛋白的表達變化以及MMP活性率的改變；（4）通過Transwell小室法，明確共培養(yǎng)體系對乳腺癌細胞MDA-MB-231遷移能力的影響；（5）用Matrigel模擬并重建基底膜，通過Transwell小室法，建立成纖維細胞HELFPTEN-與乳腺癌細胞MDA-MB-231的交互作用模型，觀察

6、 HELFPTEN-對乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　 結(jié)果：（1）與HELFPTEN-共培養(yǎng)的乳腺癌細胞系MDA-MB-231其Ki67表達較空白培養(yǎng)組和“HELF+MDA-MB-231”細胞共培養(yǎng)組顯著增高(p<0.05)。（2）流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)與HELFPTEN-共培養(yǎng)的乳腺癌細胞系MDA-MB-231具有拮抗5-FU誘導(dǎo)的細胞凋亡的作用，凋亡率明顯低于空白培養(yǎng)組和“HELF+MDA-MB-231”細胞共培養(yǎng)組 (p<0

7、.05)。（3）明膠酶譜實驗檢測發(fā)現(xiàn)HELFPTEN-以及乳腺癌細胞系MDA-MB-231共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中MMP蛋白的表達和MMP活性率均明顯高于空白培養(yǎng)組和“HELF+MDA-MB-231”細胞共培養(yǎng)組(p<0.05)。（4）Transwell遷移實驗發(fā)現(xiàn)，遷移的細胞數(shù)呈現(xiàn)以下趨勢：與HELFPTEN-共培養(yǎng)的乳腺癌細胞系MDA-MB-231＞“HELF+MDA-MB-231”細胞共培養(yǎng)組＞MDA-MB-231細胞普通培養(yǎng)組，其差異具

8、有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。（5）侵襲轉(zhuǎn)移能力比較發(fā)現(xiàn)：與HELFPTEN-共培養(yǎng)的乳腺癌細胞系MDA-MB-231＞“HELF+MDA-MB-231”細胞共培養(yǎng)組＞MDA-MB-231細胞普通培養(yǎng)組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。
　　 結(jié)論：成纖維細胞HELF可提升乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖、抗凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移能力，而PTEN表達受抑的HELF細胞，對MDA-MB-231的增殖、抗凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移能力的增