1、蜘蛛牽絲是目前已知的最為堅(jiān)韌的天然纖維之一.它具有優(yōu)異的機(jī)械特性,其超強(qiáng)的強(qiáng)度和出色的彈性是其它天然和人工材料所無(wú)法比擬的.它的強(qiáng)度非常高,同等重量的蜘蛛牽絲強(qiáng)度是鋼的五倍.蜘蛛牽絲優(yōu)異的機(jī)械特性使它在軍工、醫(yī)療、建材和紡織等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景.該研究側(cè)重于獲得便于操作且高效表達(dá)的蜘蛛牽絲蛋白基因結(jié)構(gòu),繼而開(kāi)展大規(guī)模生產(chǎn)擬蜘蛛牽絲蛋白.依據(jù)已報(bào)道的蜘蛛牽絲蛋白部分cDNA序列,設(shè)計(jì)合成了兩種不同結(jié)構(gòu)的擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體,大小分別

2、為360bp和390bp.多聚化分別得到2聚體、4聚體、6聚體、8聚體和16聚體.依據(jù)已報(bào)道的蜘蛛牽絲蛋白序列設(shè)計(jì)合成一段大小為19個(gè)氨基酸的短肽.將此短肽與載體蛋白匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián),免疫新西蘭大耳白兔,獲得抗蜘蛛牽絲蛋白血清.將得到的兩種結(jié)構(gòu)8聚體和16聚體與表達(dá)載體pET-30a連接,獲得四種表達(dá)載體pET30a-X8、pET30a-X16、pET30a-F8和pET30a-F16.轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),用IPT

3、G誘導(dǎo)表達(dá).用制備的抗蜘蛛牽絲蛋白血清做Westernblot檢測(cè)到有蜘蛛牽絲蛋白的表達(dá).表達(dá)產(chǎn)物呈梯度排列,主帶分別在85KD、165KD、85KD和165KD,與預(yù)計(jì)大小基本一致.表達(dá)量分別為800mg/L、500mg/L、200mg/L和200mg/L左右.根據(jù)山羊β-酪蛋白信號(hào)肽我們?cè)O(shè)計(jì)了一段長(zhǎng)125bp的DNA序列.將此DNA序列分別與兩種擬蜘蛛牽絲蛋白基因結(jié)構(gòu)4聚體和6聚體連接后,插入乳腺特異表達(dá)載體pBC1,最后得到四種乳

4、腺表達(dá)載體pBC1-F4,pBC1-X4,pBC1-F6和pBC1-X6.將pBC1-F4和pBC1-X6兩種表達(dá)載體用顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠.對(duì)于pBC1-X6,共獲得58只小鼠,用PCR和Southern雜交的方法檢測(cè)出10只為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠,包括5只母鼠和5只公鼠,轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率約為17﹪.經(jīng)PCR檢測(cè),大部分原代鼠的F1代都可以檢測(cè)到擬蜘蛛牽絲蛋白基因陽(yáng)性小鼠.經(jīng)Western blot檢測(cè),在5只陽(yáng)性原代母鼠和8只F1母鼠的乳

5、汁中,有2只原代母鼠和7只F1母鼠可以檢測(cè)到擬蜘蛛牽絲蛋白的表達(dá).除了有預(yù)計(jì)大小蛋白表達(dá)外,還有部分小鼠表達(dá)與預(yù)計(jì)大小不一致的產(chǎn)物.用放免方法檢測(cè)表達(dá)量在11-50mg/L.對(duì)于pBC1-F4,共出生59只小鼠,用PCR和Southern雜交的方法檢測(cè)7只為轉(zhuǎn)基因小鼠,包括3只母鼠和4只公鼠,基因整合率為12﹪.所有原代鼠的F1代都可以檢測(cè)到擬蜘蛛牽絲蛋白基因陽(yáng)性小鼠.經(jīng)Western blot檢測(cè),在3陽(yáng)性原代母鼠和6只F1母鼠的乳汁