蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接機理研究及應用.pdf_第1頁
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1、蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)是存在于前體蛋白質(zhì)中的一段插入序列,其兩側(cè)的氨基酸序列稱為蛋白質(zhì)外顯子(extein)。在蛋白質(zhì)翻譯后加工成熟過程中,蛋白質(zhì)內(nèi)含子從前體蛋白質(zhì)中自我剪切,并將兩側(cè)的蛋白質(zhì)外顯子以天然肽鍵連接形成成熟的有功能的蛋白質(zhì),這一過程被稱為蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導的蛋白質(zhì)剪接(intein-mediatedprotein splicing)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子根據(jù)其結構特征可分為三類,即標準蛋白質(zhì)內(nèi)含子(canonical inte

2、in),微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子(mini-intein)和斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子(split-intein)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子的一級結構序列中有四個位點的氨基酸殘基比較保守,分別為:蛋白質(zhì)內(nèi)含子N端第一個氨基酸殘基一般是Cys或Ser,到目前為止還沒有在天然的intein中發(fā)現(xiàn)Thr;模體B中有一個非常保守的Thr-X-X-His序列,X代表任何氨基酸殘基;模體G中蛋白質(zhì)內(nèi)含子末位氨基酸殘基一般是Asn,倒數(shù)第二位氨基酸殘基也非常保守,一般是His;下

3、游蛋白質(zhì)外顯子N端的第一個氨基酸殘基一般是Cys,Ser或Thr。但是,這些模體中的保守氨基酸殘基并不是絕對的,現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)越來越多的例外。蛋白質(zhì)內(nèi)含子和下游蛋白質(zhì)外顯子的第一個氨基酸殘基包含了剪接所需要的全部信息,不需要外界輔酶或輔因子的參與。標準蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導的蛋白質(zhì)剪接包括四步親核反應:1)蛋白質(zhì)內(nèi)含子N端第一個氨基酸殘基的側(cè)鏈親核基團-OH/-SH對上游extein和intein之間的肽鍵發(fā)動親核攻擊,發(fā)生N-O/N-S?;嘏?/p>

4、,上游extein轉(zhuǎn)移到N端第一個氨基酸殘基的側(cè)鏈上,形成(硫)酯鍵Ⅰ;2)下游extein N端第一個氨基酸殘基的側(cè)鏈親核基團-OH/-SH對(硫)酯鍵Ⅰ進行親核攻擊,上游extein轉(zhuǎn)移到下游extein N端第一個氨基酸殘基的側(cè)鏈上,形成(硫)酯鍵Ⅱ并形成分支中間產(chǎn)物;3)intein的最后一個氨基酸殘基(一般為Asn)環(huán)化生成琥珀酰亞胺環(huán),釋放intein;4)(硫)酯鍵Ⅱ發(fā)生O-N/S-N?;嘏?,形成天然肽鍵,連接上游ext

5、ein和下游extein,此步自發(fā)進行。
   在應用intein剪接外源蛋白時最重要的一點是在宿主蛋白中選擇一個合適的插入位點,因為+1位的氨基酸殘基直接參與蛋白質(zhì)剪接反應,位點選擇不合適可能會導致intein的剪接活性被抑制。Intein的剪接反應在催化活性中心完成,由保守位點的氨基酸殘基通過氫鍵和疏水作用力相互作用形成。位于活性中心的intein的第一個氨基酸殘基(1位)和下游extein的第一個氨基酸殘基(+1位)通常為

6、親核氨基酸,Cys,Ser或Thr,但是對于一個intein來說我們還不清楚這三個氨基酸殘基是否能夠互相替換,1位和+1位是不是存在著特定的組合,或者自然界中的intein對這兩個位點的組合是不是有一個偏愛性?為了回答這些問題在第三章中我們首次分析了NEB網(wǎng)站上已經(jīng)報道的500多個intein的1位和+1位氨基酸殘基的分布及組合特性,同時我們選取了6個已知具有剪接活性的mini-intein,通過定點突變將每一個intein的1位和+1

7、位的原始氨基酸殘基分別突變?yōu)榱硗鈨煞N親核氨基酸,每一個intein得到9種不同組合并檢測其剪接活性。統(tǒng)計結果表明目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的intein中l(wèi)位大部分為Cys,少量為Ser還沒有發(fā)現(xiàn)Thr的存在;本實驗結果顯示將6個mini-intein的1位的Cys突變?yōu)镾er或Thr之后,除一個intein剪接活性降低之外其余的所有突變體剪接活性都被抑制。自然界存在的intein中Cys和Ser在+1都廣泛存在,Thr占少數(shù),將6個mini-int

8、ein+1位的Cys和Ser互換之后發(fā)現(xiàn)對intein的剪接活性基本上沒有影響。當這兩個位點的氨基酸殘基作為一個組合1/+1組合進行研究時,統(tǒng)計結果顯示在自然界中Cys/Ser組合的intein數(shù)量最多,而沒有發(fā)現(xiàn)Ser/Cys組合,同樣我們的實驗結果也發(fā)現(xiàn)6個mini-intein的Cys/Ser組合都有剪接活性,而Ser/Cys都沒有剪接活性。這些發(fā)現(xiàn)對于蛋白質(zhì)剪接機制以及在目標蛋白中選擇合適的插入位點提供了有意義的數(shù)據(jù),同時我們還

9、得到了兩個剪接活性較高且+1位為Thr的mini-intein。
   Intein的四步剪接反應是可以獨立進行的,例如將1位的氨基酸殘基突變?yōu)锳la,那么第一步剪接反應則不能發(fā)生,但是第三步Asn環(huán)化可以繼續(xù)進行,因此導致C端斷裂反應,釋放C端extein;如果將intein的最后一個氨基酸殘基Asn突變?yōu)锳la,第三步和第四步反應就被阻止,只能發(fā)生前兩步反應,生成的酯鍵被水解導致N端斷裂反應,釋放N端extein。Intei

10、n的斷裂反應在蛋白質(zhì)工程領域中得到了廣泛應用,用來進行蛋白純化,連接和環(huán)化等,例如NEB公司商業(yè)化的的IMPACTM蛋白純化載體就是利用intein的N端和C端斷裂反應實現(xiàn)了蛋白的一步純化。但是,這些方法利用的都是完整的mini-intein,intein和目的蛋白在宿主體內(nèi)融合表達之后往往會發(fā)生一些自發(fā)斷裂反應,甚至有的可以達到80%,因此大大降低了目的蛋白的產(chǎn)量,增加了成本。在第四章中我們報道了一種新的方法,利用斷裂蛋白內(nèi)含子的片段

11、互補實現(xiàn)對intein斷裂反應的可控,從而避免體內(nèi)自發(fā)斷裂。我們利用S11型斷裂蛋白內(nèi)含子實現(xiàn)對intein N端斷裂的控制,用S1型斷裂蛋白內(nèi)含子實現(xiàn)對intein C端斷裂的控制。在N端斷裂反應的設計中,四個S11型斷裂蛋白內(nèi)含子Ssp DnaX,Ter ThyX,Ssp GyrB和Rma DnaB的N端序列(S11-IN)與大腸桿菌麥芽糖蛋白(MBP)融合形成前體蛋白,在大腸桿菌中表達純化,體外加入化學合成的Ssp GyrB S1

12、1split-intein的C端序列(Ic:GVFVHN)和DTT。結果表明,除了Ter ThyX之外都可以發(fā)生N-cleavage,而體內(nèi)表達和純化過程中,除了Rma DnaB有少量的自發(fā)斷裂外其余的三個intein都沒有自發(fā)斷裂發(fā)生,而且在只有DTT存在時也可以引發(fā)斷裂反應。在C端斷裂的設計中,四個S1型斷裂蛋白內(nèi)含子Ssp DnaX,Ter ThyX,Ssp GryB和Rma DnaB的C端序列(S1-IC)與大腸桿菌硫氧還蛋白(

13、Trx)融合表達,純化后在體外加入化學合成的Ssp DnaB S1split-intein的N端序列(IN:CISGDSLISLA)。結果表明,除了SspDnaX在體內(nèi)有自發(fā)斷裂外,其余三個intein都沒有自發(fā)斷裂發(fā)生,體外加入IN和DTT可以誘發(fā)斷裂反應。本實驗利用小肽和intein大片段的互補形成完整的intein結構,從而恢復intein的活性來控制其N端或C端斷裂反應,同時我們利用一個intein的小肽來控制多個intein的

14、斷裂反應。因此,本實驗不僅提供了一個經(jīng)濟有效的方法避免intein的自發(fā)斷裂,還對intein的結構有了進一步的了解。
   Liu等對Ssp DnaB S1 split-intein的研究以及我們對Ter ThyX,Ssp GyrB和Rma DnaB三個S1 split-intein的研究發(fā)現(xiàn),缺失11aa的S1-IN片段之后剩余的S1-Ic片段沒有任何的cleavage和splicing活性,只有在體外加入S1-IN片段才可

15、以誘發(fā)S1-Ic片段發(fā)生C-cleavage,而對于Ssp DnaX intein結果卻相反。在缺失11aa的S1-IN片段之后剩余的137-aa的S1-Ic片段仍然表現(xiàn)出自發(fā)的C-cleavage活性。在進一步縮短S1-Ic片段的實驗中發(fā)現(xiàn),Ssp DnaXmini-intein在缺失N端15個氨基酸殘基即整個Motif A之后仍然有C-cleavage活性。同時我們突變了137-aa的S1-Ic片段block B中的兩個保守氨基酸殘

16、基His和Thr,結果發(fā)現(xiàn)將Thr突變?yōu)锳la之后其C-cleavage活性被大大抑制。這些結果表明了一個具有強生命力intein的發(fā)現(xiàn),同時表明Block B中的Thr在intein的第三步剪接反應中可能發(fā)揮了很大的作用,這一部分結果在第五章中有詳細討論。
   利用斷裂蛋白內(nèi)含子的反式剪接可以將進行多肽片段連接,蛋白環(huán)化,NMR片段標記,基因治療以及蛋白標記,蛋白修飾等。在第六章中我們利用蛋白質(zhì)內(nèi)含子反式剪接開劈了一條新途徑

17、,將三個具有高剪接活性的S0型斷裂蛋白內(nèi)含子Rma DnaB,Ssp GyrB和Ter DnaE-3的N端和C端剪接區(qū)域分別與蜘蛛絲基因的編碼序列融合表達,以大腸桿菌為表達宿主,融合蛋白表達純化后通過體外剪接得到分子量為256kDa的重組蜘蛛絲蛋白,克服了大腸桿菌不能表達高分子量蛋白的缺點。我們還利用定向進化得到的具有高剪接活性的Ssp GryB intein來剪接蓖麻毒素蛋白的A鏈(RicinA)。將RicinA斷裂成兩個沒有功能的片

18、段,在斷裂位點處分別插入SspGyrB intein的野生型和四個突變型,篩選出具有高剪接活性的mini-intein,然后將其斷裂為S11 split-intein,并在大腸桿菌內(nèi)表達純化和進行體外剪接,得到剪接產(chǎn)物,目前剪接效率只有約50%。因此,下一步的目標是提高剪接效率,并將融合基因分別克隆到病毒載體上,通過病毒顆粒包裝,具有特異性導向性的病毒顆粒將攜帶這兩段融合基因通過特異性抗原抗體識別進入癌細胞,在癌細胞內(nèi)表達融合蛋白,通過

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