1、高效低毒的基因遞送載體是將治療基因(pDNA或siRNA)遞送到靶細胞,發(fā)揮穩(wěn)定基因治療作用的關(guān)鍵。陽離子聚合物非病毒基因載體具有易于制備,無免疫原性,結(jié)構(gòu)可修飾性等優(yōu)勢。胍基官能團對磷酸根骨架的核酸分子具有高親合性,且對磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的細胞膜具有較強的穿透能力。因此,本文引入胍基化策略,制備了基于N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺(GPMA)結(jié)構(gòu)的陽離子共聚物載體,并進一步考察了共聚物/pDNA復(fù)合物的細胞毒性、攝取能力和轉(zhuǎn)染效率。

2、　　 通過鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合法制備N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺(APMA)-co-N-2-羥丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物,然后將APMA鏈節(jié)上的伯胺基完全胍基化,得到胍基化APMA-co-HPMA,即N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺-cvo-N-2-羥丙基甲基丙烯酰胺(GPMA-co-HPMA,GH)共聚物。經(jīng)靜態(tài)光散射法測定GPMA-co-HPMA共聚物的重均分子量為54100-79600 g/mol,胍基化APMA均聚物的分子量為28

3、800 g/mol。采用HeLa細胞進行GPMA-co-HPMA共聚物/pDNA復(fù)合物的細胞毒性、細胞攝取及轉(zhuǎn)染實驗。由共聚焦顯微鏡分析的細胞攝取結(jié)果顯示,GPMA鏈節(jié)比例≥60％的GPMA-co-HPMA共聚物/pDNA復(fù)合物粒子部分聚集于細胞核內(nèi),表明聚合物中高比例的胍基不僅可促進聚合物穿透細胞膜,還可促進穿透核膜。GPMA-co-HPMA共聚物在有、無血清存在的條件下均實現(xiàn)了有效的細胞轉(zhuǎn)染。胍基化策略顯著降低了GPMA-co-HP

4、MA共聚物的細胞毒性并增強了共聚物在較低N/P下的轉(zhuǎn)染效率。當N/P=4時,GPMA-co-HPMA共聚物表現(xiàn)出比PEI更高的轉(zhuǎn)染效率,體現(xiàn)了GPMA-co-HPMA共聚物基因載體高效低毒的特點。
　　 為了賦予GPMA-HPMA共聚物基因載體靶向細胞的能力,本文進一步采用RAFT聚合法制備得到HPMA-b-APMA嵌段共聚物,然后將具有肝細胞靶向功能的半乳糖基團接枝到APMA嵌段的伯胺基上,再將剩余伯胺基完全胍基化,得到了半乳

5、糖化的嵌段共聚物(GHG)。經(jīng)硫酸苯酚法測定,半乳糖基團在共聚物GPMA嵌段中的含量為6.5-8.0%。細胞毒性實驗結(jié)果表明,GalactosylatedHPMA-b-GPMA嵌段共聚物對肝癌HepG2細胞和宮頸癌HeLa細胞中的毒性作用均低于PEI。GPMA嵌段含量≥30.23%的Galactosylated HPMA-b-GPMA嵌段共聚物在HepG2細胞的轉(zhuǎn)染試驗中表現(xiàn)出優(yōu)于PEI的轉(zhuǎn)染效率,表明GHG嵌段共聚物上的半乳糖基團有效

6、介導(dǎo)了肝腫瘤細胞表面去唾液酸糖蛋白(ASGP)受體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)染過程。HPMA嵌段有效掩蔽了Galactosylated HPMA-b-GPMA嵌段共聚物表面正電荷,降低了有血清轉(zhuǎn)染過程中蛋白在聚合物表面的聚集。
　　 為了提高聚合物載體在血清存在條件下的轉(zhuǎn)染效率,本文選取了具有長循環(huán)效應(yīng)的聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)與陽離子單體APMA通過水相RAFT聚合,共聚物中APMA的實際含量經(jīng)茚三酮法測得為45.43%。在合成的AP

7、MA-co-PEGMA共聚物上接枝不同比例的半乳糖基團,剩余伯胺基完全以胍基替代,得到肝細胞靶向的半乳糖化N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯共聚物(GGP)。半乳糖基團降低了N/P較高時GGP共聚物對HepG2細胞的毒性作用。半乳糖接枝量≥5.83%的GGP共聚物可有效介導(dǎo)HepG2細胞表面ASGP受體調(diào)節(jié)的細胞內(nèi)在化過程,提高GGP在靶細胞中的轉(zhuǎn)染效率。共聚物中占54.57%比例的親水鏈段PEGMA有效抑制了血清中