1、研究背景:
　　 當前，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展及人民生活水平的提高，糖尿病（Diabetes Mellitus）已成為威脅人類生命健康的重要疾病。在糖尿病中，又以2型糖尿?。═ype 2 Diabetes Mellitus）為主，目前我國20歲以上糖尿病患者人數(shù)已達9 240萬，成為全世界糖尿病患者人數(shù)最多的國家。糖尿病的危害主要在于其嚴重的并發(fā)癥，包括心腦血管疾病、視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、糖尿病足等，其中心臟合并癥是糖尿病患者死亡

2、的主要原因。雖然關于糖尿病心臟并發(fā)癥的發(fā)生機理已有大量研究，但主要集中在冠脈血管損傷以及炎癥反應的影響，對心肌細胞直接的損傷研究仍然較少。
　　 硫氧還蛋白（Thioredoxin, Trx）系統(tǒng)是體內重要的氧化還原蛋白系統(tǒng)，廣泛表達于各種細胞，在很多有自由基損傷和凋亡發(fā)生的疾病如炎癥，腫瘤,再灌注損傷等的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮重要作用。糖尿病時表現(xiàn)顯著的糖、脂代謝異常，有大量自由基產(chǎn)生，而Trx系統(tǒng)是體內重要的抗自由基損傷物質，因

3、此我們推測Trx系統(tǒng)可能參與了糖尿病時各種損傷的發(fā)生。我們前期使用在體動物的研究表明，在2型糖尿病模型大鼠中，有心肌損傷和心肌細胞凋亡發(fā)生，同時糖尿病可通過抑制硫氧還蛋白還原酶（Thioredoxin Reductase，TR）的活性、增加硫氧還蛋白相互作用蛋白（Trx interacting protein，TXNIP；又名硫氧還蛋白結合蛋白—Trx binding protein-2，TBP2；或維生素D3上調蛋白-1—Vitami

4、ne D3 upregulatedprotein-1，VDUP-1）的表達而抑制Trx活性，在模型早期甚至可以直接減少Trx表達而抑制心肌Trx功能，從而削弱Trx的抗凋亡作用而誘導心肌細胞凋亡。
　　 糖尿病引起心肌細胞損傷的原因可能有很多，髙糖高脂刺激、中性粒細胞等炎癥細胞產(chǎn)生的TNF-α等炎性介質、冠脈血管的損傷等均有可能參與糖尿病心臟損傷的發(fā)生。為明確糖尿病時體內高糖高脂是否對心肌細胞有直接損傷作用，以及心肌細胞本身的T

5、rx系統(tǒng)是否發(fā)生變化并介導高糖高脂的損傷，使用培養(yǎng)的心肌細胞進行研究就成為必然的選擇。雖然在培養(yǎng)乳鼠心肌細胞中發(fā)現(xiàn)，高糖、高脂刺激可以引起心肌細胞損傷，但是乳鼠心肌細胞呈梭形，生長旺盛，其結構、對外界刺激的反應和抵抗力等與成熟細胞有較大差別。因此，在本研究中，我們建立了成年大鼠心肌細胞的分離與培養(yǎng)模型，在此基礎上給予高糖、高脂刺激模擬2型糖尿病，并運用LDH活性測定，caspase活性檢測技術觀察給予高糖高脂刺激后心肌細胞損傷及凋亡發(fā)生

6、情況；運用胰島素還原法檢測Trx活性及TR活性改變；運用Real-time PCR，Western Blot等方法測定給予高糖高脂刺激后培養(yǎng)的心肌細胞中Trx系統(tǒng)成員及TXNIP的表達情況，從而進一步探討Trx系統(tǒng)和TXNIP在高糖高脂培養(yǎng)的成年大鼠心肌細胞凋亡中的作用。
　　 目的：1. 建立成年大鼠心肌細胞培養(yǎng)模型，觀察給予高糖高脂刺激是否可以引起心肌細胞凋亡，并了解其損傷和凋亡程度；2. 了解高糖高脂培養(yǎng)造成的心肌細胞損傷

7、中硫氧還蛋白系統(tǒng)主要成員活性和表達的變化，并分析其與心肌細胞凋亡之間的關系；3．了解高糖高脂培養(yǎng)引起心肌細胞凋亡時，TXNIP是否發(fā)生變化，并分析其與心肌細胞凋亡的關系。
　　 方法:1．成年大鼠心肌細胞的分離與培養(yǎng)以及實驗分組選取體重約250g的雄性成年SD大鼠，肝素化并麻醉后，迅速開胸取出心臟，經(jīng)主動脈插管固定在Langendorff 離體心臟灌流裝置上，灌流洗凈殘血后用酶液消化至心臟呈毛玻璃狀，取下并置于stop 液中剪碎

8、并吹打使細胞分散，過濾所得細胞懸液梯度鈣化。最后將細胞懸液用培養(yǎng)基調至適當濃度后接種至35mm 培養(yǎng)皿中，隨機分為兩組：正常對照組：使用含葡萄糖5 mmol/L的常規(guī)M199 培養(yǎng)基加入甘露醇20mmol/L作為對照培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；高糖高脂組：使用含有葡萄糖25 mmol/L、軟脂酸600μmol/L的M199 培養(yǎng)基作為高糖高脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。兩組細胞均于37 oC，5％ CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)基上清與培養(yǎng)細胞待測。

9、2．指標檢測測定培養(yǎng)基上清中乳酸脫氫酶（LDH）活性反映心肌細胞壞死情況，測定心肌細胞caspase-3活性反映心肌細胞的凋亡程度，測定caspase-8和caspase-9活性分析心肌細胞的凋亡途徑，以胰島素還原法測定心肌細胞中Trx活性和TR活性，以Real-time PCR法測定心肌細胞Trx1、Trx2、TR1、TR2和TXNIP的mRNA水平，以Western Blot法測定心肌細胞Trx1、Trx2、TR1、TR2和TXNI

10、P的蛋白表達。
　　 結果:1．成年大鼠心肌細胞培養(yǎng)48h后形態(tài)學觀察培養(yǎng)的成年大鼠心肌細胞呈桿狀，細胞內可見明顯的肌原纖維結構，而培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞則呈三角形或梭形，故成鼠心肌細胞與乳鼠的相比，更接近成年在體情況，在科研上具有更高的價值。2．乳酸脫氫酶活性測定正常對照組乳酸脫氫酶活性為(715.2±128.2) U/L，高糖高脂組乳酸脫氫酶活性為(1054.6±122.9) U/L，與正常對照組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義

11、（P<0.01）。該結果表明培養(yǎng)的成年大鼠心肌細胞膜發(fā)生了損傷，乳酸脫氫酶大量漏出，有壞死性的心肌細胞損傷參與。3．凋亡增加3.1Caspase-3 活性分析經(jīng)檢測，培養(yǎng)48h后，與正常對照組成年大鼠心肌細胞相比，高糖高脂組心肌細胞caspase-3 活性顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義[(0.0829±0.0115) nmol?h-1?mg-1pro.vs.(0.0543±0.0118) nmol?h-1?mg-1pro., P<0.01

12、)]。3.2 Caspase-8和Caspase-9 活性分析經(jīng)檢測，培養(yǎng)48h后，與正常對照組成年大鼠心肌細胞相比，高糖高脂組心肌細胞caspase-8 活性和caspase-9 活性均顯著升高[caspase-8 活性：(0.1991±0.0334)nmol?h-1?mg-1pro.vs. (0.1446±0.0279) nmol?h-1?mg-1pro.; caspase-9 活性：(0.1036±0.0146)nmol?h-1?

13、mg-1pro.vs. (0.0653±0.0170) nmol?h-1?mg-1pro., P 均<0.01]。4．高糖高脂組成年大鼠心肌細胞Trx 系統(tǒng)活性降低4.1高糖高脂組成年大鼠心肌細胞Trx 活性降低經(jīng)檢測，培養(yǎng)48h后，高糖高脂組成年大鼠心肌細胞與正常對照組心肌細胞相比，其Trx 相對活性顯著降低 (0.24±0.17vs. 1.00±0.37, P<0.01)。4.2 高糖高脂組成年大鼠心肌細胞TR 活性降低經(jīng)檢測，培養(yǎng)

14、48h后，高糖高脂組成年大鼠心肌細胞與正常對照組心肌細胞相比，其TR 相對活性顯著降低 (0.60±0.22vs. 1.00±0.28, P<0.01)。5．培養(yǎng)48h后成年大鼠心肌細胞Trx 系統(tǒng)mRNA水平和蛋白表達變化5.1培養(yǎng)的成年大鼠心肌細胞Trx 系統(tǒng) mRNA水平變化培養(yǎng)48h后，與正常對照組心肌細胞相比，高糖高脂組成年大鼠心肌細胞Trx1、Trx2mRNA水平未見明顯改變；而TR1和TR2 mRNA水平下降，差異具有顯著

15、性(Trx1:1.052±0.189vs. 1.000±0.000, P>0.05; Trx2：0.999±0.258vs.1.000±0.000, P>0.05; TR1:0.862±0.126vs. 1.000±0.000, P<0.05; TR2：0.803±0.174vs. 1.000±0.000, P<0.05)。5.2 培養(yǎng)的成年大鼠心肌細胞Trx 系統(tǒng)蛋白表達變化培養(yǎng)48h后，與正常對照組心肌細胞相比，高糖高脂組成年大鼠心

16、肌細胞Trx1和Trx2蛋白表達未見明顯差異；而TR1和TR2蛋白表達明顯降低，差異均具有顯著性(Trx1:0.74±0.26vs. 1.00±0.44, P>0.05; Trx2:0.68±0.21vs. 1.00±0.37, P>0.05; TR1：0.55±0.19vs. 1.00±0.40, P<0.05; TR2：0.49±0.20vs. 1.00±0.55, P<0.05)。6．培養(yǎng)48h后成年大鼠心肌細胞TXNIP mRN

17、A水平和蛋白表達變化6.1培養(yǎng)的成年大鼠心肌細胞TXNIP mRNA水平變化培養(yǎng)48h，與正常對照組大鼠心肌細胞相比，高糖高脂組成年大鼠心肌細胞TXNIPmRNA水平顯著升高(1.418±0.302vs. 1.000±0.000, P<0.01)。6.2 培養(yǎng)的成年大鼠心肌細胞TXNIP蛋白表達變化培養(yǎng)48h后，與正常對照組大鼠心肌細胞相比，高糖高脂組成年大鼠心肌細胞TXNIP蛋白表達顯著升高(1.63±0.57vs. 1.00±0.1