1、目的：
　　先天性心臟畸形(congenital heart defects，CHDs)是最常見的先天畸形之一，發(fā)病率約為活產(chǎn)嬰兒的1.9％-7.5％，在死產(chǎn)或自然流產(chǎn)的胎兒中比例更高。我國每年約有10萬-15萬CHDs患兒出生，為新生兒時期的主要死亡原因之一，對患兒及其親屬乃至整個社會都造成沉重的負(fù)擔(dān)。
　　因此，CHDs的早期診斷以及發(fā)生機(jī)制的研究，對于開展CHDs的預(yù)防或產(chǎn)前干預(yù)，具有十分重要的意義。目前，臨床工作中尚

2、沒有產(chǎn)前篩查CHDs的分子標(biāo)志物，CHDs的產(chǎn)前診斷主要依賴于產(chǎn)前超聲檢查。然而，胎兒超聲心動圖僅僅在一些產(chǎn)前診斷中心得以開展，只有少部分高危妊娠孕婦能夠得到檢查，并且診斷準(zhǔn)確率受操作者主觀診斷能力的影響較大。而且超聲對CHDs檢出時間較晚，許多孕婦發(fā)現(xiàn)CHDs時孕周較大，且很多復(fù)雜心臟畸形是生后手術(shù)難以矯正的。在孕婦的外周血中篩選出畸形相關(guān)標(biāo)志物被公認(rèn)為產(chǎn)前診斷的最理想方式。首先，它可以避免傳統(tǒng)的有創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法（如羊水穿刺、臍血穿刺

3、等）帶來的風(fēng)險;其次，它可以作為一種篩查手段在基層醫(yī)院得以開展，結(jié)果異常的建議進(jìn)一步做超聲心動圖檢查;再次，這種檢查手段有可能早期發(fā)現(xiàn)CHDs，這為早期臨床決策及靶向治療提供了重要依據(jù)。
　　以蛋白質(zhì)組學(xué)為基礎(chǔ)，在孕婦的血清、羊水以及代謝產(chǎn)物中篩選出妊娠相關(guān)分子標(biāo)志物方面的研究在過去幾年中取得了顯著進(jìn)展。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在產(chǎn)前主要被應(yīng)用于染色體異常胎兒標(biāo)志物的篩查，對胎兒結(jié)構(gòu)畸形產(chǎn)前標(biāo)志物篩查的研究甚少。本研究中，我們結(jié)合了非

4、靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)——同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)(isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ)與靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)——多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜技術(shù)(multiple reaction monitoring massspectrometry，MRM-MS)比較CHD孕婦與正常孕婦外周血中的蛋白表達(dá)差異，并利用經(jīng)典的ELISA技術(shù)進(jìn)行大樣本驗證，篩選出CHD孕婦產(chǎn)前無創(chuàng)診斷的蛋

5、白質(zhì)標(biāo)志物。
　　方法：
　　一、孕婦血清與胎兒心臟標(biāo)本收集
　　1、共收集正常孕婦、CHD胎兒孕婦、其它結(jié)構(gòu)畸形胎兒孕婦以及正常孕齡期婦女外周血血清420例。
　　(1) CHD組:2011年9月至2014年12月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心診斷為胎兒單純先天性心臟畸形孕婦外周血血清180例，孕周22-26周;
　　(2)正常對照組:選擇孕齡和年齡均與CHD組相匹配（22-26周）的正常孕婦90

6、例作為對照組;
　　(3)其它孕周組:選擇年齡與對照組相匹配的正常孕婦不同孕周外周血血清80例，其中8-10周、16-19周、32-34周、38-40周各20例。
　　(4)未孕組:年齡與對照組相匹配的孕齡期婦女（既往身體健康，無妊娠史）外周血血清20例。
　　(5)16-19周CHD組:在16-19周診斷為CHDs的孕婦外周血血清10例。
　　(6)其它系統(tǒng)畸形:選取周齡、孕婦年齡與對照組相匹配的單純唇腭裂、單

7、純神經(jīng)管畸形、單純?nèi)旧w異常、其它單一系統(tǒng)畸形（單純消化系統(tǒng)畸形4例、單純泌尿系統(tǒng)畸形4例、單純肢體畸形2例）孕婦外周血血清各10例。
　　所有孕婦均為單胎妊娠，既往身體健康，不合并妊娠高血壓、糖尿病等其它系統(tǒng)疾病。孕婦均簽署知情同意書，于清晨7:00-8:00抽取空腹靜脈血5ml，4℃靜置1h，3000 rpm離心10min，取上清，每管200ul分裝，-80℃保存。
　　2、共收集胎兒心臟組織8例
　　(1)CHD

8、組:22-26周CHD胎兒心臟大體標(biāo)本4例，
　　(2)正常對照組:選擇與CHD組孕周、孕婦年齡、胎兒性別相匹配的心臟發(fā)育正常的胎兒心臟組織4例。所有心臟組織-80℃保存。
　　二、同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)(iTRAQ)對差異蛋白質(zhì)的篩選
　　不同亞型的先心病可能呈現(xiàn)不同的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，因此在標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)階段，我們設(shè)置了4個先心病亞型組和一個對照組。這樣既可以篩選出先心病特異的標(biāo)志物，也可以觀察到不同亞型之間表達(dá)是

9、否有差異，避免不同亞型先心病混合后對某些蛋白質(zhì)表達(dá)的掩蓋。4組先心病樣本中，每組10例樣本混合，前3組是3種比較常見的先心?。ǚ迨纤穆?lián)征，室間隔缺損，共同動脈干），另外一組是幾種少見的不同亞型先心病的混合。對照組為10例正常孕婦血清混合?；旌虾蟮臉颖居肞roteo miner試劑盒進(jìn)行血清高豐度蛋白去除，提取蛋白;對提取后的蛋白樣品進(jìn)行還原烷基化處理，打開二硫鍵以便后續(xù)步驟充分酶解蛋白;用Brand ford法進(jìn)行蛋白的濃度測定;SD

10、S（十二烷基磺酸鈉）-PAGE;取等量蛋白Trypsin酶解;用iTRAQ試劑標(biāo)記肽段;將標(biāo)記后的肽段進(jìn)行等量混合;對混合后的肽段使用強(qiáng)陽離子交換色譜（Strong Cation Exchange Choematography，SCX）進(jìn)行預(yù)分離;最后進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography coupled with tandemmassspectrometry，LC-MS/MS)分析。
　　三、生物信息學(xué)分析

11、及候選標(biāo)志物的預(yù)測
　　1、生物信息學(xué)分析
　　應(yīng)用Mascot檢索軟件、GO注釋、COG注釋、Pathway代謝通路注釋、多樣品間表達(dá)模式聚類分析等生物信息學(xué)方法對差異蛋白進(jìn)行功能分析。
　　2、候選標(biāo)志物的選擇標(biāo)準(zhǔn)
　　(1)在CHD與正常對照組血清之間差異顯著，表達(dá)差異在1.5倍以上。
　　(2)差異重復(fù)性好，在不同亞型CHD中穩(wěn)定表達(dá)。
　　(3)質(zhì)譜檢測信號強(qiáng)，信噪比高。
　　(4)功

12、能檢索提示該蛋白應(yīng)具有較重要的生理功能，在胚胎發(fā)育及代謝過程中具有一定的生物學(xué)作用。
　　四、多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜技術(shù)(MRM-MS)對差異蛋白質(zhì)的驗證
　　1、確定目標(biāo)蛋白質(zhì)
　　根據(jù)生物信息學(xué)結(jié)果確定目標(biāo)蛋白質(zhì)，并根據(jù)目標(biāo)蛋白的已知信息預(yù)測目標(biāo)蛋白的代表肽段。
　　2、預(yù)測可行的transitions。
　　在選擇肽段的transition時，首要條件要保證所選肽段在樣本背景中能唯一代表目標(biāo)蛋白。同時，其它選

13、擇條件如肽段長度一般為6-15氨基酸、母離子+2或+3價，m/z小于1000，子離子為y離子、肽段無轉(zhuǎn)錄后或化學(xué)修飾、無漏切位點(diǎn)等都是選擇最優(yōu)的transitions需要綜合考慮的條件。
　　結(jié)果：
　　一、iTRAQ技術(shù)對差異蛋白質(zhì)的鑒定
　　應(yīng)用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定差異蛋白，在孕婦外周血血清中共鑒定到蛋白質(zhì)606個，表達(dá)差異在1.5倍以上的蛋白質(zhì)47個，其中23個表達(dá)上調(diào)，24個表達(dá)下調(diào)，這些差異蛋白部

14、分在所有亞型組中均差異表達(dá)，部分在一種或幾種亞型組中差異表達(dá)。這47個差異蛋白的功能主要涉及到應(yīng)激反應(yīng)、脂類代謝、發(fā)育過程、細(xì)胞構(gòu)成等生物過程。
　　二、MRM-MS技術(shù)對差異蛋白質(zhì)的驗證
　　在iTRAQ技術(shù)鑒定得到的47種差異蛋白中，LMNA，TPM4，F(xiàn)LNA，MYH9，APOC1，PF4V1，SAA2，SAA4，HP，ACTG1和NRX2B11種蛋白在3種以上亞型組中均差異表達(dá)，我們應(yīng)用MRM-MS技術(shù)對這11種蛋白

15、進(jìn)行進(jìn)一步的驗證，這樣得到的標(biāo)志物更有希望診斷不同亞型先心病。
　　應(yīng)用MRM技術(shù)成功對11種蛋白質(zhì)中的9種進(jìn)行相對定量，另外兩種蛋白（FLNA和ACTG1）因為信號強(qiáng)度較低不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量。驗證實(shí)驗在一個獨(dú)立樣本中完成，CHD組22例，對照組20例，每個樣品重復(fù)檢測3次。MRM結(jié)果顯示CHD組中LMNA，TPM4明顯下調(diào)，APOC1表達(dá)明顯上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，這三種蛋白的驗證結(jié)果與iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)篩選的結(jié)果一致。MY

16、H9，PF4V1，HP，SAA4在MRM結(jié)果中差異不明顯;SAA2，NRX2B在CHD組中表達(dá)明顯下調(diào)，這與iTRAQ篩選得到的結(jié)果相反。
　　三、ELISA技術(shù)對候選標(biāo)志物的驗證
　　我們應(yīng)用ELISA技術(shù)對MRM進(jìn)一步篩選得到的候選標(biāo)志物在一個獨(dú)立的相對較大的樣本中進(jìn)行進(jìn)一步的驗證，MRM技術(shù)沒能準(zhǔn)確定量的兩種蛋白質(zhì)FLNA和ACTG1也被納入ELISA的驗證實(shí)驗。
　　結(jié)論：
　　1、本實(shí)驗首次將定量蛋白質(zhì)

17、組學(xué)iTRAQ技術(shù)應(yīng)用于先天性心臟畸形產(chǎn)前診斷標(biāo)志物的研究當(dāng)中。我們應(yīng)用該技術(shù)成功獲得了CHD胎兒孕婦血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜。
　　2、我們結(jié)合靶向蛋白質(zhì)組學(xué)MRM-MS技術(shù)和經(jīng)典ELISA技術(shù)對差異蛋白進(jìn)行驗證，得到了一組蛋白質(zhì)標(biāo)志物(LMNA，F(xiàn)LNA，TPM4，ACTG1)在產(chǎn)前診斷CHDs中具有較高的敏感性和特異性。這些蛋白質(zhì)均為細(xì)胞骨架蛋白，提示這些骨架蛋白在心臟發(fā)育過程中可能發(fā)揮了重要作用。
　　3、LMNA作為單