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![多角體融合的家蠶表皮膜蛋白N141的高效表達與純化.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/11/8/f57efa4b-fbc5-492d-abed-69d03ea8d5ca/f57efa4b-fbc5-492d-abed-69d03ea8d5ca1.gif)
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文檔簡介
1、膜蛋白是生物膜功能的主要承擔者,其結構、功能的研究對了解認識膜蛋白起著至關重要的作用,而研究的前提是純化膜蛋白。由于膜蛋白一般整合在生物膜上,同時表達量又十分有限,往往難以分離純化。本論文研究將多角體蛋白基因與膜蛋白基因分別在大腸桿菌和家蠶細胞中實現(xiàn)高效融合表達并開展純化研究。
本研究從本實驗室構建的家蠶跨膜蛋白序列cDNA文庫中篩選獲得一條cDNA序列,將其命名為N141。經(jīng)生物信息學分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白含有保守結構
2、域chitin_bind_4,該序列含有一435 bp的開放閱讀框,預測編碼144個氨基酸殘基,編碼蛋白質分子量大小為16.9kDa,有一個跨膜區(qū)。根據(jù)其ORF框設計上下游引物,PCR擴增目的基因并克隆到載體pBacPAK8-Polh中,構建重組質粒pBacPAK8-Polh-N141。用BamH I和EcoR I雙酶切上述重組質粒,將Polh-N141基因片段克隆到載體pET-28a的相應酶切位點,成功構建重組質粒pET-28a-Po
3、lh-N141。用IPTG誘導含重組質粒的工程菌表達,裂解菌液經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting分析鑒定發(fā)現(xiàn)融合蛋白高效表達且主要以包涵體的形式存在于沉淀中。利用多角體蛋白基因強啟動子特性,使得融合蛋白Polh-N141高效表達。利用多角體蛋白的溶解度特性,通過梯度pH洗滌法即梯度pH值的Tris·Cl緩沖液洗滌沉淀來純化融合蛋白。純化的融合蛋白經(jīng)Western blotting和肽指紋圖譜證實該蛋白為帶有多聚組氨酸標
4、簽的融合蛋白。將純化的融合蛋白用TEV酶切去除多角體,以純化膜蛋白N141。利用多角體蛋白的相關性質,使膜蛋白大量表達且便捷純化。同時,利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng),將Polh-N141基因片段克隆到載體pFastBacHTb,構建重組質粒pFastBac-Polh-N141并轉化DH10Bac E.coli,與家蠶桿狀病毒基因組Bacmid發(fā)生轉座,得到重組桿狀病毒基因組并轉染家蠶細胞BmN以獲取重組桿狀病毒vPolh-N
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