1、椎間盤發(fā)育和退變中的相關(guān)基因變化及機(jī)制知之甚少。我們先前的研究發(fā)現(xiàn),EMP1在退變的椎間盤髓核組織中高表達(dá)；文獻(xiàn)報道其同家族基因perp的敲除會導(dǎo)致馬哈魚的脊索發(fā)育異常；另一個同家族基因PMP22在骨肉瘤細(xì)胞中明顯高表達(dá)；這些發(fā)現(xiàn)表明該家族基因很可能在椎間盤細(xì)胞發(fā)育和退變中發(fā)揮著重要的作用。目前為止還沒有它們在人椎間盤細(xì)胞中功能的研究報道,深入研究這些基因?qū)θ俗甸g盤細(xì)胞的影響,將有助于了解椎間盤細(xì)胞發(fā)育和退變的機(jī)制。鑒于EMP1在退變的

2、人椎間盤細(xì)胞中表達(dá)明顯升高,我們選擇EMP1作為研究對象。 一、EMP1對椎間盤發(fā)育的影響 為了研究EMP1對椎間盤發(fā)育的影響,我們培養(yǎng)了發(fā)育中的人胚(胎齡4個月左右)椎間盤髓核細(xì)胞,并分別構(gòu)建EMP1的高表達(dá)慢病毒載體和干涉慢病毒載體。轉(zhuǎn)染后半定量RT-PCR與western blot證明所建立的高表達(dá)EMP1和低表達(dá)EMP1的細(xì)胞模型成功。而后熒光倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；繪制細(xì)胞生長曲線觀察細(xì)胞增殖情況；CC

3、K8檢測細(xì)胞活力；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下觀察細(xì)胞黏附能力；半定量RT-PCR檢測細(xì)胞I型膠原、II型膠原的表達(dá)變化；在放線菌酮、十字孢堿作用或懸浮培養(yǎng)后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示：高表達(dá)EMP-1后細(xì)胞的活力增強(qiáng)、增殖加快、周期進(jìn)程改變、存活能力增強(qiáng)、形態(tài)變化顯著,粘附能力減弱,細(xì)胞外基質(zhì)合成改變,長期培養(yǎng)未出現(xiàn)肥大細(xì)胞；干涉EMP1基因后椎間盤細(xì)胞活力下降、增殖減慢、G0/G1期細(xì)胞減少、凋亡增加。

4、 這些結(jié)果對于椎間盤組織發(fā)育的意義在于： 1、椎間盤發(fā)育過程中,腹部鞏膜刀的細(xì)胞需要遷移至中間形成脊索周圍管,這些細(xì)胞隨后發(fā)生濃聚,產(chǎn)生細(xì)胞濃度的階段性差異,濃度高的地方發(fā)育為椎間盤,低的地方形成椎體。在這些過程中,細(xì)胞需要克服相互之間的連接、抵抗遷移中細(xì)胞失去附著所導(dǎo)致的失巢凋亡,并把握遷移的方向。EMP1基因能減弱細(xì)胞間的黏附、提高細(xì)胞抗失巢凋亡的能力、同時增強(qiáng)細(xì)胞極性有助于細(xì)胞在遷移中把握方向。 2、椎間盤和椎骨都

5、源于脊索和脊索周圍的間充質(zhì)祖細(xì)胞,隨后都軟骨化,形成透明樣軟骨。然而椎骨部分的軟骨細(xì)胞似乎出現(xiàn)更快的分化進(jìn)程,出現(xiàn)了軟骨內(nèi)成骨,即：軟骨細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟,增殖停滯,體積肥大,分泌的基質(zhì)改變,凋亡增加,最終軟骨細(xì)胞消失,成骨細(xì)胞安家,軟骨礦化為骨。EMP1似乎可以阻滯這一過程,當(dāng)對照組的細(xì)胞出現(xiàn)類似上述的表現(xiàn)時,高表達(dá)EMP1的細(xì)胞依然增殖較快,沒有出現(xiàn)肥大的細(xì)胞,凋亡較少,細(xì)胞外基質(zhì)合成不同于對照組。說明EMP1可能在椎骨和椎間盤不同

6、的發(fā)育方向選擇上發(fā)揮了重要作用。 二、EMP1在退變椎間盤細(xì)胞中的作用 為了研究EMP1在退變椎間盤細(xì)胞中的作用,我們分離培養(yǎng)了成體退變椎間盤髓核細(xì)胞,轉(zhuǎn)染干涉慢病毒后半定量RT-PCR與western blot驗證干涉模型,熒光倒置相差顯微鏡檢測細(xì)胞的形態(tài)變化；繪制細(xì)胞增長曲線檢測細(xì)胞增殖；CCK8檢測細(xì)胞活力；剝奪血清或放線菌酮作用后流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡情況；半定量RT-PCR檢測細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)。結(jié)果顯示：干涉EM

7、P1在成體退變椎間盤髓核細(xì)胞的表達(dá)后,細(xì)胞收縮變圓、增殖減慢、活力下降、凋亡增加、增殖期細(xì)胞比例降低、Ⅰ型膠原纖維表達(dá)下降。 這些結(jié)果的可能具有以下意義： 1、健康的椎間盤包括很少均勻、稀疏分布的細(xì)胞,然而退變椎間盤則會特征性的出現(xiàn)細(xì)胞簇,研究表明這些細(xì)胞具有較強(qiáng)增殖能力。我們之前發(fā)現(xiàn)退變的椎間盤組織高表達(dá)EMP1,本實驗中敲減EMP1的表達(dá),降低了退變髓核細(xì)胞的增殖能力,說明EMP1的高表達(dá)是導(dǎo)致退變椎間盤中細(xì)胞增殖增