1、目的:類風濕關節(jié)炎（rheumatic arthritis，RA）是一種系統性自身免疫性疾病，疾病最終階段伴有關節(jié)進行性損傷和殘疾，嚴重影響患者生活質量。對類風濕關節(jié)炎早期有效的治療，可以緩解患者癥狀，延緩疾病進展，降低RA的致殘率，大大提高患者的生活質量。生物制劑從20世紀90年代中期已經開始應用于臨床，對RA的治療藥物包括TNF因子拮抗劑，IL-1受體拮抗劑，IL-6受體拮抗劑類等。雖然生物制劑的出現為RA的治療帶來了革新，但RA具

2、有異質性，仍有很大部分患者對現有的RA治療方法不敏感。越來越多的基礎和臨床研究，著眼于在滑膜炎中起重要作用的細胞因子，以期為RA治療尋找新的靶點。細胞因子IL-22是具有179個氨基酸長度的蛋白質，為IL-10家族中的成員之一。對腫瘤的研究發(fā)現IL-22具有促進腫瘤增殖，抑制腫瘤細胞凋亡的作用，并且與腫瘤的遠處轉移相關。RA的滑膜組織具有腫瘤組織樣特性，異常增殖，抑制凋亡，侵蝕性等。對RA的臨床研究發(fā)現，IL-22與RA發(fā)生、發(fā)展相關，

3、具體機制尚不明確。細胞凋亡即程序性死亡，是細胞在活體組織中被完全清除的過程。細胞凋亡的啟動有外源性通路和內源性通路，當細胞表面的凋亡相關受體，如Fas與相應的配體結合，啟動凋亡為細胞外源性通路，當Bcl-2家族前凋亡蛋白表達引起線粒體外膜通透性增加啟動凋亡為細胞內源性通路。兩個通路共同激活半胱天冬酶蛋白酶家族(Caspase家族)，最終引起細胞凋亡。目前IL-22對滑膜細胞凋亡的影響報道尚少。本實驗主要研究IL-22對類風濕關節(jié)炎患者滑

4、膜成纖維細胞(rheumatic arthritis fibroblast-likesynoviocytes，RA-FLS)凋亡的影響及其機制，為RA治療提供新的靶點。
　　研究方法:滑膜組織均來自大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2015.1～2015.7行人工關節(jié)置換術的RA患者。對滑膜組織進行原代培養(yǎng)，獲得RA-FLS。WB(westernblotting)方法檢測IL-22R1、pSTAT3-Y705，pSTAT3-S727，STA

5、T3、Bcl-XL、 Bcl-2蛋白表達。MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide))法檢測細胞活性，AV/PI(annexin V/propidium iodide)染色流式細胞術檢測細胞凋亡百分數。時實熒光PCR(real-time PCR)法檢測Bcl-XL和Bcl-2 mRNA的表達。
　　實驗結果:1、RA-FLS表達IL-22R1。

6、用WB方法檢測RA-FLS中IL-22R1的表達，結果顯示，RA-FLS細胞與陽性對照細胞HepG2比較，IL-22R1的表達無差異。結果表明RA-FLS高表達IL-22R1。2、IL-22促進SNP誘導的RA-FLS增殖、抑制凋亡。用SNP誘導RA-FLS細胞凋亡，用MTT法檢測加入不同濃度的IL-22后RA-FLS細胞活性變化，用AV/PI檢測細胞凋亡百分數變化。結果顯示不同劑量的IL-22作用，1ng/ml IL-22對SNP誘導

7、的RA-FLS細胞活性影響不明顯，10 ng/ml、100ng/ml IL-22能增加細胞活性，抑制SNP誘導的RA-FLS凋亡的發(fā)生。IL-22(10ng/ml)+SNP組較SNP組，細胞凋亡百分數明顯減少（51.11±1.23 vs67.87±4.75，p＜0.05），IL-22(100ng/ml)+SNP組較SNP組，細胞凋亡百分數減少更明顯（34.25±1.98 vs67.87±4.75，p＜0.01）。3、IL-22通過STA

8、T3通路抑制RA-FLS細胞凋亡。首先，WB法檢測pSTAT3-Y705和pSTAT3-S727表達，結果顯示IL-22作用30分鐘后，RA-FLS中pSTAT3-Y705和pSTAT3-S727表達就明顯增加，有統計學意義，表明IL-22可以激活STAT3通路。其次，加入STAT3通路特異性抑制劑HO3867或STA21，AV/PI染色流式細胞術檢測細胞凋亡，結果顯示SNP+IL-22+HO3867組較SNP+IL-22組（48.91

9、±2.99 vs31.41±4.55，p＜0.05）、SNP+IL-22+STA21組較SNP+IL-22組（61.97±7.09 vs31.41±4.55，p＜0.05），細胞凋亡百分數均明顯增加，HO3867、STA21抑制了IL-22對RA-FLS的保護作用。4、IL-22激活STAT3通路下游靶基因Bcl-2、Bcl-XL表達。用WB法和rt-PCR檢測STAT3下游靶基因Bcl-XL、 Bcl-2轉錄表達。WB結果顯示SNP+

10、IL-22組較SNP組Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達明顯增加，加入STAT3抑制劑的SNP+IL-22+HO3867組、SNP+IL-22+STA21組較SNP+IL-22組Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達均明顯減低，有統計學意義(p＜0.05); real-time PCR測得Bcl-2、Bcl-XLmRNA水平變化與WB測得的Bcl-2、Bcl-XL蛋白水平變化結果相一致。IL-22促進SNP誘導的RA-FLS細胞Bcl-2、Bc