1、目的:
　　初步探索高遷移率蛋白1(High Mobility Group Box Chromosomal Protein1，HMGB1)-脂多糖(LipopolysacLcharide，LPS)復(fù)合物誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(Rheumatoid Arthritis Synovial Fibroblasts，RASF)自噬(autophagy)水平上調(diào)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）發(fā)生發(fā)展

2、中所起到的作用，及其分子機(jī)制，為RA的臨床診治提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。
　　方法:
　　我們采取體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相互驗(yàn)證的方法，深入探討了HMGB1-LPS復(fù)合物在誘導(dǎo)RASF發(fā)生自噬過(guò)程中所起到的分子機(jī)制，本研究分為兩個(gè)部分:
　　第一部分 收集骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)和RA病人關(guān)節(jié)滑膜石蠟切片病理標(biāo)本，分別用免疫組化方法檢測(cè)HMGB1、自噬相關(guān)蛋白5(Autophagy related geneprod

3、uct5，Atg5)、BECN編碼蛋白1(Beclin1)、微管相關(guān)蛋白質(zhì)輕鏈3(microtubule-associated protein-light chain3，LC3)分子在RA和OA滑膜組織中的表達(dá)情況。應(yīng)用Real-time PCR的方法檢測(cè)OA和RA病人關(guān)節(jié)滑膜組織自噬相關(guān)基因(Beclin1，Atg5，LC3)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。采用熒光Tunel法分別檢測(cè)骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(Osteoarthritis Sy

4、novial Fibroblasts，OASF)和RASF的細(xì)胞凋亡情況。分析患者病理切片的染色陽(yáng)性細(xì)胞比例和陽(yáng)性的強(qiáng)弱，可得到兩組患者病損關(guān)節(jié)滑膜組織免疫組化的評(píng)分結(jié)果。分析RASF和OASF間HMGB1、自噬和凋亡相關(guān)分子的表達(dá)差異，以及這些分子表達(dá)情況與病人疾病活動(dòng)度指標(biāo)[C型反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、類風(fēng)濕因子（Rheumatoid Factor，RF）、環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic c

5、irullinatedpeptide antibodies，CCP抗體)、紅細(xì)胞沉降率(Erythrocyte Sedimentation Rate，ESR)]間的關(guān)系。
　　第二部分 將RASF傳代培養(yǎng)于六孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)80-90％之間即可開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。按照空白對(duì)照組、HMGB1刺激組、LPS刺激組和HMGB1-LPS復(fù)合物刺激組依次向各處理組加入刺激劑，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后收集各處理組蛋白。蛋白質(zhì)印跡法(Western Bl

6、ot，WB)檢測(cè)LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的表達(dá)變化和灰度比值的數(shù)量變化，同時(shí)檢測(cè)Beclin1的變化;細(xì)胞免疫熒光染色觀察各處理組Beclin1和Atg5的表達(dá)情況;透射電鏡觀察各刺激組RASF自噬情況;采用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(FITC-AnnexinⅤ/PI染色法）和流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組RASF細(xì)胞的凋亡率;用WB檢測(cè)Bax、Bcl-2的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)HMGB1-LPS刺激的RASF細(xì)胞表面Toll樣受體-2(Toll-like re

7、ceptors2，TLR-2)、Toll樣受體-4（Toll-like receptors4，TLR-4）和糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)的表達(dá)變化。設(shè)計(jì)針對(duì)TLR-2、TLR-4和RAGE三個(gè)受體的siRNA，觀察siRNA抑制各受體后，HMGB1-LPS刺激RASF的自噬表現(xiàn)。PathScan Akt signaling antibody arra

8、y kit篩選可能激活的信號(hào)通路，再進(jìn)一步采用WB驗(yàn)證蛋白芯片初篩的結(jié)果。采用免疫化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的IL-1β、IL-2受體、IL-6、IL-8、IL-10以及TNF-α的水平。
　　結(jié)果:
　　1、納入研究的RA組和OA組病人臨床資料。
　　非選擇性地將20例RA病人和16例OA病人納入研究。RA組病人血清學(xué)疾病活動(dòng)度相關(guān)指標(biāo)ESR和CRP水平均顯著高于OA組病人，且納入的20例RA患者的血清CRP全部

9、高于8mg/L，其中18例(90％) ESR高于20 mm/h; CCP抗體的陽(yáng)性率高達(dá)90％，濃度范圍為25-273.01 RU/ml; RF的陽(yáng)性率為95％，濃度范圍為25-143.3 KIU/L，均顯著高于OA組病人。
　　2、RA病人關(guān)節(jié)滑膜組織自噬相關(guān)蛋白和HMGB1的表達(dá)水平顯著高于OA病人。
　　為明確RA和OA病人關(guān)節(jié)滑膜組織自噬相關(guān)蛋白和HMGB1的表達(dá)水平差異，采用Real-time PCR和/或免疫組化

10、的方法分別檢測(cè)了RA及OA病人關(guān)節(jié)滑膜組織中Beclin1、Atg5、LC3及HMGB1的表達(dá)情況。與16例OA組病人滑膜組織相比，20例RA組病人滑膜組織中Beclin1、Atg5和LC3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，同時(shí)HMGB1的表達(dá)水平亦顯著上調(diào)。RA組病人關(guān)節(jié)滑膜組織中Beclin1、LC3、Atg5和自噬相關(guān)蛋白的陽(yáng)性染色免疫組化評(píng)分顯著高于OA組病人(P＜0.001)。
　　3、OA組病人關(guān)節(jié)滑膜組

11、織中成纖維細(xì)胞凋亡水平明顯高于RA組病人。
　　為明確RA和OA病人關(guān)節(jié)滑膜組織中成纖維細(xì)胞的凋亡水平差異，采用In SituCell Death Detection kit，POD分別檢測(cè)了RA及OA病人關(guān)節(jié)滑膜組織中成纖維細(xì)胞的凋亡情況。與16例OA組病人滑膜組織相比，20例RA組病人滑膜組織中成纖維細(xì)胞的凋亡水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。根據(jù)陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比對(duì)RA組和OA組個(gè)病人TUNEL(TdT-me

12、diated dUTP Nick-End Labeling)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，OA組病人關(guān)節(jié)滑膜組織中成纖維細(xì)胞凋亡評(píng)分顯著高于RA組病人(P＜0.001)。
　　4、RA病人關(guān)節(jié)滑膜組織自噬相關(guān)蛋白和HMGB1表達(dá)水平與疾病活動(dòng)度血液指標(biāo)的相關(guān)性。
　　采用Pearson雙變量相關(guān)分析的方法，分析RA病人關(guān)節(jié)滑膜組織LC3蛋白和HMGB的免疫組化評(píng)分與同一患者血清中反映疾病活動(dòng)度指標(biāo)水平的相關(guān)關(guān)系。RA患者病損關(guān)節(jié)滑膜組織

13、中LC3和HMGB1表達(dá)的免疫組化評(píng)分與同一患者ESR和CRP水平均呈強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系（P均＜0.05）;與CCP抗體和RF水平亦均呈強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系P＜0.001和P=0.002）。
　　5、RA病人關(guān)節(jié)滑膜組織滑膜成纖維細(xì)胞凋亡水平與疾病活動(dòng)度血液指標(biāo)的相關(guān)性。
　　本研究中我們采用Pearson雙變量相關(guān)分析的方法，分析RA病人關(guān)節(jié)滑膜組織滑膜成纖維細(xì)胞TUNEL凋亡實(shí)驗(yàn)打分結(jié)果與同一患者血清中反映疾病活動(dòng)度指標(biāo)水平的相關(guān)關(guān)系

14、。RA患者病損關(guān)節(jié)滑膜組織中滑膜成纖維細(xì)胞TUNEL凋亡實(shí)驗(yàn)打分結(jié)果與同一患者ESR和CRP水平呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)關(guān)系（P均＜0.05）;與RA相關(guān)性自身抗體抗CCP和RF的血清水平亦呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)關(guān)系（P均＜0.05）。
　　6、HMGB1-LPS可以誘導(dǎo)RASF的自噬激活和凋亡減弱，細(xì)胞的增殖速度加快。
　　WB檢測(cè)顯示，與空白對(duì)照組、HMGB1刺激組、LPS刺激組相比較，HMGB1-LPS復(fù)合物處理組RASF的自噬水平明顯增高;透

15、射電鏡觀察各刺激組自噬情況，能夠觀察到胞漿中大量的自噬小體和自噬溶酶體;間接免疫熒光染色在HMGB1-LPS復(fù)合物處理組RASF也觀察到Beclin1和Atg5表達(dá)增高的現(xiàn)象。采用AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HMGB1-LPS復(fù)合物處理組RASF的凋亡率明顯降低。WB的檢測(cè)結(jié)果顯示，HMGB1-LPS復(fù)合物處理組RASF Bcl-2/GADPH的比值明顯升高，Bax/GADPH的比值顯著降低。采用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑

16、盒經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HMGB1-LPS復(fù)合物刺激組RASF細(xì)胞進(jìn)入S/G2期明顯增多，細(xì)胞增殖速度加快。表明HMGB1-LPS復(fù)合物刺激組RASF的自噬激活，細(xì)胞凋亡水平明顯降低，細(xì)胞增殖速度加快。
　　結(jié)論:
　　在本研究中，我們證實(shí)了RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織高表達(dá)HMGB1和自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3和Atg5，這些分子表達(dá)的增高與臨床血清疾病活動(dòng)度指標(biāo)的水平呈強(qiáng)正向關(guān)系;滑膜成纖維細(xì)胞凋亡顯著減少，滑膜成纖維細(xì)

17、胞凋亡數(shù)與臨床血清疾病活動(dòng)度指標(biāo)的水平呈負(fù)向關(guān)系。提示，RA患者病損滑膜組織存在自噬/凋亡的失衡，促進(jìn)了疾病的進(jìn)展;HMGB-1極有可能參與或介導(dǎo)了病損滑膜組織自噬/凋亡的失衡。在體外實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)，HMGB1-LPS復(fù)合物刺激體外培養(yǎng)的RASF，可以誘導(dǎo)RASF表面TLR-4表達(dá)水平顯著上調(diào)，通過(guò)TLR-4激活自噬相關(guān)信號(hào)通路Akt-mTOR使RASF自噬功能明顯增強(qiáng)，凋亡水平下降，細(xì)胞增殖明顯加快;同時(shí)亦激活炎癥相關(guān)性信號(hào)通路NF-κ