1、目的：我國是乙型肝炎病毒(bepatitis B virus,HBV)感染的高發(fā)區(qū)域,有約50％的人口曾經(jīng)感染過HBV,目前仍約9300萬慢性HBV感染者。HBV可引起不同的臨床結(jié)果,包括有隱匿感染、急性乙肝、慢性乙肝、肝衰竭,肝硬化和肝細(xì)胞癌等,嚴(yán)重危害人類健康。至今,乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。大量研究結(jié)果表明HBV感染的清除和病理損傷主要決定于機(jī)體的免疫應(yīng)答狀態(tài),感染的病毒通過激發(fā)免疫反應(yīng)間接引起肝細(xì)胞損害。在針對HBV的免疫

2、應(yīng)答反應(yīng)中,特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)在清除病毒和決定疾病轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。在急性乙型肝炎患者體內(nèi)存在較強(qiáng)的多克隆CTL反應(yīng),HBV很快能清除,而慢性乙型肝炎患者的外周血中往往CTL反應(yīng)很弱或針對的病毒抗原表位單一,導(dǎo)致不能完全清除HBV；同時(shí),CTL反應(yīng)也與免疫病理損傷的程度和類型相關(guān)。引起這種HBV特異性CTL反應(yīng)差異的機(jī)制目前尚不完全清楚,可能與機(jī)體(如炎性因子基因多態(tài)性、

3、HLA亞型及CTL細(xì)胞本身)和病毒(如病毒變異和病毒載量)有關(guān)。CTL的特異性取決于細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR),而TCR的特性主要決定于α和β鏈可變(Ⅴ區(qū))區(qū)的分子組成,因此,揭示特異性CTL的TCR分子的組成特點(diǎn)對深入理解HBV免疫應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制十分重要。本研究從分析乙型肝炎患者在疾病進(jìn)展不同階段的外周血CTL表達(dá)頻率入手,進(jìn)而分析乙型肝炎患者HBV抗原表位特異性CD8+T淋巴細(xì)胞TCRα和β鏈的取用

4、特點(diǎn),并找到可配對的α和β鏈基因,構(gòu)建到特異性質(zhì)粒中,在特定細(xì)胞中人工表達(dá)TCR分子,為進(jìn)一步研究CTL的功能,幫助闡明乙型肝炎患者特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的特點(diǎn)及其分子機(jī)制和乙型肝炎的免疫治療提供幫助。
　　 方法：⑴研究對象為2008年1月至2010年12月在我們醫(yī)院(解放軍第302醫(yī)院)住院的40例急性乙型肝炎患者和40例慢性乙型肝炎患者,另有15例名健康志愿者作為正常入對照。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2000年9月(西安)全國會議修訂的《病

5、毒性肝炎防治方案》標(biāo)準(zhǔn),排除甲型肝炎、丙型肝炎戊型肝炎及藥物、自身免疫因素等重疊引起肝功損害的因素。⑵采集40例急性乙型肝炎患者、40例慢性乙型肝炎患者和15例正常人血樣進(jìn)行HLA-A2檢測。HLA-A2陽性的患者及正常人(18例急性乙肝患者、18例慢性乙肝患者、6例正常人)均提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(其中急性乙肝患者取急性期和恢復(fù)期兩份血樣),另選取6例HLA-A2陰性的急性乙型肝炎患者亦提取外周血單個(gè)核細(xì)胞。經(jīng)CD3、CD8和HBV多肽

6、抗原(HBsAg183-191,HBsAg335-343)特異性五聚體熒光染色,分析特異性CD8T細(xì)胞頻率。⑶急性乙肝患者中18例為HLA-A2陽性,取患者血樣提取基因組DNA擴(kuò)增HLA-A基因座基因,通過膠回收后測序,通過DNA序列測定確定HLA-A2亞型?；颊叩腍BV DNA載量、HBV抗原抗體5項(xiàng)和生化檢測解放軍第302醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心完成。⑷HLA-A2陽性急性乙肝患者中,取6例患者PBMC,用HBsAg335—343表位多

7、肽誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4周,用磁珠分選出CD8T細(xì)胞后再用流式細(xì)胞術(shù)分選HBV特異性CD8 T細(xì)胞,經(jīng)IL-2/CD3抗體/CD28抗體擴(kuò)增后提取細(xì)胞mRNA,用cDNA5’末端快速擴(kuò)增技術(shù)(5’RACE)獲取TCR分子α鏈和β鏈全長可變區(qū)基因片段并進(jìn)行克隆和測序,每個(gè)樣本的克隆測序數(shù)≥50個(gè)。通過Vector NTI等軟件和IMGT/PhyloGene網(wǎng)站對所獲序列結(jié)果進(jìn)行分析。確定TCRα鏈、β鏈基因家族并比較CDR3區(qū)序列特點(diǎn)。⑸確定構(gòu)成

8、TCR分子的α鏈、β鏈分子配對,應(yīng)用cDNA5’末端快速擴(kuò)增技術(shù)(5’RACE)獲取兩個(gè)分子的5’端,cDNA3’末端快速擴(kuò)增技術(shù)(3’RACE)獲取分子的3’端,然后應(yīng)用OVER-LAP PCR構(gòu)建全長α鏈、β鏈分子,分別導(dǎo)入表達(dá)質(zhì)粒SAMEN CMV/SRα中,經(jīng)過包裝細(xì)胞包裝后,取病毒上清感染Jakurt細(xì)胞,篩選出表達(dá)特異性TCR分子的細(xì)胞,為CTL功能試驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　 結(jié)果：①18例HLA-A2陽性急性乙肝患者急性期

9、HBsAg183—191的特異性CTL頻率為0.23％±0.18％,HBsAg335-343為0.49％±0.31％,較HLA-A2陽性的慢性乙肝患者發(fā)病極期上述抗原的特異性CTL頻率(0.07％±0.03％和0.08±0.04％)明顯升高(P<0.01)。HLA-A2陰性急性乙肝患者和HLA-A2陽性正常人均未檢出上述個(gè)抗原的特異性CTL。②HBsAg183-191的特異性CTL頻率與ALT峰值無顯著相關(guān)性(r=0.4506,P=0.

10、0528),而且HBsAg335—343特異性CTL頻率與ALT水平呈正相關(guān)(r=0.5642,P=0.0119),但上述CTL頻率與HBV載量無相關(guān)性。③對8例患者進(jìn)行了外周血HBV特異性CTL頻率的動態(tài)分析,患者在發(fā)病極期的CTL頻率為0.75±0.42,顯著高于患者在恢復(fù)期的特異性CTL頻率0.42±0.30,(P=0.011)。④HLA-A2亞型與優(yōu)勢CTL袁位多肽相關(guān),HLA-A0201和A0203陽性急性乙型肝炎患者的HBs

11、Ag335—343特異性CTL頻率顯著高于HBsAg183—191特異性CTL頻率(0.56±0.63％vs.0.21±0.27％,P=0.0413),而HLA-A0207和A0206陽性急性乙型肝炎患者的HBsAg183-191特異性CTL頻率相對較高(0.17±0.31 vs.0.33±0.47％,P=0.0749)。⑤對6例急性乙肝患者樣本600多個(gè)TCRα鏈和β鏈克隆基因序列分析的結(jié)果提示,HBV特異性CTL均呈現(xiàn)TCR分子α鏈

12、、αβ鏈基因家族優(yōu)勢表達(dá)特點(diǎn),每例患者樣本以24種α鏈和1-4αβ鏈家族為主,其中α2、α14、α15、β3、β13和β23家族同時(shí)出現(xiàn)在l例以上患者,有1例患者所有克隆分析的β鏈基因均為β13家族。⑥同一患者同一家族α、α鏈CDR3區(qū)序列趨于一致,而不同患者同一家族α、β鏈CDR3區(qū)序列相差較大。⑦成功合成TCR分子α、β鏈全長基因。進(jìn)一步行載體構(gòu)建及包裝,轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞進(jìn)行特異性TCR分子表達(dá),實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中。