1、食管癌（Esophageal carcinoma, EC）是世界上最常見的癌癥類型之一。食管鱗狀細(xì)胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma, ESCC）和腺癌（Esophageal Adenocarcinoma, EA）是食管癌最常見的兩種類型。西方國家食管腺癌較多，而在中國食管鱗狀細(xì)胞是其中最主要的組織學(xué)類型。盡管在治療食管鱗狀細(xì)胞癌方面，外科手術(shù)、放療及化療已經(jīng)取得的很大的進(jìn)步，但是食管鱗狀細(xì)胞癌患

2、者五年生存率仍不理想。晚期食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后較差生活質(zhì)量較低。因此，迫切的需要一個(gè)可靠的生物標(biāo)志物來識別伴有高度不良預(yù)后的患者，并且指導(dǎo)其治療。
　　已經(jīng)報(bào)道表觀遺傳改變，包括DNA甲基化及組蛋白共價(jià)修飾，涉及各種腫瘤基因的沉默，促進(jìn)腫瘤發(fā)生或者人類癌癥的進(jìn)展。其中最重要的機(jī)制是通過EZH2沉默許多癌癥相關(guān)基因，EZH2可以使靶基因啟動(dòng)子處組蛋白H3賴氨酸K27發(fā)生三甲基化。本研究利用免疫組織化學(xué)法分別檢測 EZH2及 H3K

3、27me3在食管鱗癌組織和相應(yīng)正常食管組織中的表達(dá)及與其臨床生物學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系，及與患者預(yù)后關(guān)系。并通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）、Western-blot方法檢測EZH2及H3K27me3在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)，并通過Transwell侵襲小室及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)探討了EZH2對食管癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響，以期為 EZH2及 H3K27me3作為判斷患者不良預(yù)后的指標(biāo)提

4、供理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　第一部分 EZH2和H3K27me3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及對預(yù)后的意義
　　目的：
　　探討EZH2和 H3K27me3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織，相應(yīng)正常組織中的表達(dá)及與其臨床生物學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系，尤其是與預(yù)后關(guān)系。
　　方法：
　　1、實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測96對食管鱗狀細(xì)胞癌及其癌旁組織中EZH2mRNA的表達(dá)。
　　2、應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測96例食

5、管鱗狀細(xì)胞癌組織及相應(yīng)正常組織中 EZH2和 H3K27me3蛋白的表達(dá)，分析其與患者臨床生物學(xué)指標(biāo)及其預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本EZH2 mRNA水平明顯高于癌旁組織。96例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中EZH2的陽性率為84.4％(81/96)；而相應(yīng)癌旁組織中EZH2高表達(dá)占51.0%(49/96)。
　　2、EZH2和 H3K27me3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)陽性率明顯高于癌旁組織。在食管

6、鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中，EZH2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，但是 H3K27me3則僅表達(dá)在細(xì)胞核中。EZH2和 H3K27me3在食管鱗狀細(xì)胞癌癌旁組織表達(dá)陽性率分別占44.8%(43/96)和26.0%(25/96)，低于食管鱗狀細(xì)胞癌組織70.8%（68/96）和47.9%（46/96）。
　　3 EZH2和 H3K27me3表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者病理學(xué)特征的關(guān)系。EZH2蛋白的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤部位及腫瘤分期不相關(guān)(

7、P?0.05)。EZH2蛋白的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)位轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P＜0.05)。H3K27me3蛋白表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤部位、及腫瘤分期無關(guān)(P?0.05)。H3K27me3蛋白表達(dá)與食管癌患者組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)遠(yuǎn)位轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P＜0.05)。
　　4 EZH2和 H3K27me3表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者總生存期間的關(guān)系。Kaplan-Meier生存數(shù)據(jù)顯示EZH2表達(dá)陽性患者

8、的平均生存期41.175個(gè)月，明顯短于EZH2表達(dá)陰性患者(54.166個(gè)月)(χ2=13.218, P=0.000)。同樣，H3K27me3表達(dá)陽性的患者平均生存期38.677個(gè)月，明顯短于H3K27me3表達(dá)陰性患者(50.800個(gè)月)(χ2=15.990, P=0.000)。EZH2和H3K27me3表達(dá)均陽性的患者平均生存期為36.136個(gè)月，明顯短于僅有一種蛋白陽性患者(48.027個(gè)月)或者兩個(gè)蛋白均陰性患者(55.627個(gè)

9、月)。
　　5 Cox回歸分析數(shù)據(jù)表明EZH2表達(dá)(HR,3.574;95%CI,1.742-7.331;P=0.001)、組織學(xué)分級(HR,2.042;95%CI,1.200-3.475;P=0.008)及淋巴結(jié)遠(yuǎn)位轉(zhuǎn)移(HR,8.667;95%CI,4.280-17.547;P?0.001)是影響食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。盡管 H3K27me3并沒有顯示出是影響食管鱗狀細(xì)胞癌患者獨(dú)立的預(yù)后因素，但是共表達(dá) EZH2和

10、H3K27me3與食管鱗狀細(xì)胞癌患者遠(yuǎn)位轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(χ2=15.681;P=0.000)。
　　結(jié)論：
　　EZH2和 H3K27me3可以作為食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。
　　第二部分 EZH2和H3K27me3在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其對食管癌細(xì)胞侵襲能力的影響
　　目的：
　　檢測食管癌細(xì)胞株KYSE30、KYSE170、TE1、Eca109細(xì)胞中EZH2的表達(dá)，并通過轉(zhuǎn)染 EZ

11、H2過表達(dá)載體或 shEZH2載體研究 EZH2與H3K27me3的關(guān)系及對食管癌細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　方法：
　　1應(yīng)用 qRT-PCR、Western Blot方法檢測食管癌細(xì)胞株 KYSE30、KYSE170、TE1、Eca109中EZH2的表達(dá)情況。
　　2應(yīng)用 qRT-PCR、Western Blot方法檢測食管癌細(xì)胞過表達(dá)/沉默EZH2對H3K27me3基因表達(dá)水平的影響。
　　3應(yīng)用qRT-PC

12、R分析食管癌細(xì)胞過表達(dá)/沉默EZH2對MMP1、MMP2、MMP7及 MMP9基因表達(dá)水平的影響。
　　4通過劃痕實(shí)驗(yàn)分析過表達(dá)/沉默 EZH2后食管癌細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力。
　　5通過Transwell實(shí)驗(yàn)分析過表達(dá)/沉默EZH2后食管癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　結(jié)果：
　　1 qRT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示Eca109及 TE1細(xì)胞中EZH2和H3K27me3明顯高于KYSE30及 KYSE170

13、細(xì)胞中EZH2和 H3K27me3表達(dá)水平（P＜0.05）。
　　2 Western Blot結(jié)果顯示過表達(dá)EZH2質(zhì)粒的KYSE30和 KYSE170食管癌細(xì)胞系中H3K27me3蛋白的表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.05）。
　　3 Western Blot結(jié)果顯示EZH2沉默組的Eca109及 TE1食管癌細(xì)胞系中H3K27me3蛋白的表達(dá)水平顯著低于對照組（P＜0.05）。
　　4 qRT-PCR結(jié)果顯示 KY

14、SE30和 KYSE170食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染 EZH2后MMP1、MMP2、MMP7及 MMP9 mRNA水平較對照組相比明顯升高（P＜0.05）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示 KYSE30及KYSE170轉(zhuǎn)染 EZH2組侵襲能力顯著高于對照組（P＜0.05）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示與對照組相比轉(zhuǎn)染EZH2組KYSE30及KYSE170細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。
　　5 qRT-PCR結(jié)果顯示ShEZH2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Eca109和

15、TE1食管癌細(xì)胞系后MMP1、MMP2、MMP7及 MMP9 mRNA水平較對照組相比明顯降低（P＜0.05）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明Eca109和TE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染ShEZH2質(zhì)粒組穿過Transwell侵襲小室細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示與對照組相比轉(zhuǎn)染ShEZH2質(zhì)粒組Eca109和TE1細(xì)胞遷移能力明顯降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　EZH2可增加靶基因啟動(dòng)子上組蛋白H3第