1、目的：
　　 構建GDNF基因修飾的臍帶間充質干細胞(UCMSCs),為組織工程化神經(jīng)的構建打下基礎。
　　 方法：
　　 1.用CaCl2法制備感受態(tài)大腸桿菌,重組逆轉錄病毒載體質粒(第三軍醫(yī)大學阮懷珍教授惠贈)轉化入感受態(tài)細菌并進行抗性篩選,抽提純化質粒。酶切、測序檢測目的基因的正確性。
　　 2.復蘇包裝細胞PA317,用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)、傳代擴增,待細胞生長至80％融合時,脂質體轉染法將重組逆轉錄病

2、毒PLXSN-GDNF轉染進入PA317包裝細胞,G418篩選產(chǎn)毒克隆細胞,收集病毒上清液并測定病毒滴度。
　　 3.取健康剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦捐獻的臍帶,用組織塊法培養(yǎng)獲得原代細胞、胰酶消化傳代,取第2代臍帶間充質干細胞(UCMSCs),免疫組織化學法檢測細胞表面抗原CD44、CD105、CD106、CD34、CD45的表達情況。
　　 4.病毒上清感染臍帶間充質干細胞后篩選轉基因細胞,即GDNF-UCMSCs,收集細胞并用反轉

3、錄聚合酶鏈反應法(RT-PCR)檢測GDNF在mRNA水平的表達。
　　 結果：
　　 1.XholⅠ單酶切重組質粒,出現(xiàn)0.66kb和5.93kb兩個片段,與預期結果相符。測序檢測結果顯示重組逆轉錄病毒PLXSN-GDNF中大鼠GDNF的編碼序列完整。
　　 2.用小鼠成纖維細胞NIH3T3檢測逆轉錄病毒滴度,挑選四個克隆檢測,最高病毒滴度為6.56×104cfu/ml,選用該病毒上清液感染細胞。
　　

4、 3.原代培養(yǎng)1周時組織塊之間出現(xiàn)貼壁的成纖維樣細胞,14天左右集落細胞達到80%-90%融合,成螺旋狀或放射狀。免疫組化檢測細胞表面抗原示:CD44、CD105強陽性,CD106弱陽性,CD34、CD45陰性,與臍帶間充質干細胞(UCMSCs)的生物學特性相符。
　　 4.RT-PCR法檢測顯示,GDNF-UCMSCs組呈陽性,而UCMSCs組呈陰性,轉基因組GDNF mRNA水平表達明顯強于對照組,P＜0.01,差異有統(tǒng)計學