1、搜予單位代碼學(xué)號或申請?zhí)柮茌?0459020793公開鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文論文題目：作者姓名：學(xué)科門糞：專業(yè)名稱：導(dǎo)師姓名、職稱：hTERT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建及其介導(dǎo)的臍血問充質(zhì)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移研究劉瑞敏醫(yī)學(xué)生理學(xué)邢瑩教授二零零五年五月十日塑型點堂!!墮手墮主蘭垡望文hTERT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建及其介導(dǎo)的臍血問充廈干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移研究本實驗的目的是要構(gòu)建hTERT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在臍血MSCs原代培養(yǎng)和純化的基礎(chǔ)上導(dǎo)入hTERT基因，觀察該

2、基因?qū)δ氀狹SCs細(xì)胞端粒酶活性的影響，是否能夠延長細(xì)胞的生命周期，并觀察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的分化能力。為進(jìn)一步研究臍血MSCs的生物學(xué)特性及為組織工程學(xué)打下基礎(chǔ)。方法1采集健康正常分娩產(chǎn)婦志愿捐獻(xiàn)的臍血，用PBS(phosphatebufferedsalinePH74)進(jìn)彳亍1：1稀釋，密度梯度離心分離單個核細(xì)胞(mononuclearcells，MNCs)，PBS洗滌2次后重懸于含15％胎牛血清的HlDMEM中，以110r／ml接種于50m

3、l培養(yǎng)瓶中，三天后換液，以后隔“sd全量換液。長至80％融合后用025％的胰酶和002％EDTA混合液消化后傳代。2用PCR法從質(zhì)粒pEGFPhTERTCl擴(kuò)出h11ERT的全部cDNA片斷，用DNA重組技術(shù)將hTERT基因定向克?。疦pLNCX2載體。3用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法將病毒質(zhì)粒導(dǎo)入包裝細(xì)胞內(nèi)，用0418篩選出陽性產(chǎn)毒細(xì)胞克隆，測定病毒滴度。取陽性克隆的病毒上清感染臍血MSCs，篩選出轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，我們將其命名為hTERTMSCs細(xì)

4、胞。采用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptpolyrnemsechainreactionRT—PCR)方法檢測臍血MSCs轉(zhuǎn)染前后hTERT在mRNA水平的表達(dá)；采用端粒酶重復(fù)序列擴(kuò)增法(telomererepeatamplificationprotocolassay，TRAP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELIsA)法檢測人臍位tMSCs轉(zhuǎn)染前后端粒酶活性的變化；采用MTT法(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法)測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生

5、長曲線，觀llTERT轉(zhuǎn)入后對細(xì)胞增殖的影響。4用5一氮雜胞苷罐J：hTERTMSCs向心肌方向誘導(dǎo)。用細(xì)胞免疫組織化學(xué)方法檢測心肌特異抗體：鼠抗人n橫紋肌肌動蛋白單克隆抗體(鼠抗肌d—Sareomericactin)，兔抗人連接體43多克隆抗體(Connexin43)的表達(dá)。結(jié)果1用BglII和NotI雙酶切鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒，酶切圖譜為61kb和36kb兩個片段，證明逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLNCX2hTERT構(gòu)建成功。2用NIH3T3細(xì)胞檢測