1、目的:研究膽固醇對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞DNA的損傷及絞股藍(lán)總苷的保護(hù)作用。
　　 方法:1.培養(yǎng)并鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(CRL-1730)。2.三種方法檢測(cè)γH2AX:用12.5mg/L,25mg/L,50mg/L膽固醇作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞12小時(shí),免疫熒光法觀(guān)察細(xì)胞中γH2AX形成的焦點(diǎn);Westernblot及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)γH2AX表達(dá)量變化。3.先用NAC(10mM)或1μg/mL,10μg/mL,100μg/mL,絞股

2、藍(lán)總苷預(yù)作用細(xì)胞1小時(shí),再用50mg/L膽固醇作用細(xì)胞12小時(shí),免疫熒光法觀(guān)察細(xì)胞中γH2AX形成的焦點(diǎn),Westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)7H2AX表達(dá)量變化:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化。
　　 結(jié)果:1.成功培養(yǎng)了人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(CRL-1730),經(jīng)免疫熒光鑒定為內(nèi)皮細(xì)胞。2.不同濃度的膽固醇作用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞12小時(shí)后,免疫熒光結(jié)果顯示不同濃度的膽固醇均可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)γH2AX形成焦點(diǎn),隨著膽固醇濃度的增加,

3、γH2AX形成焦點(diǎn)的熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng);Westernblot結(jié)果及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,膽固醇作用后細(xì)胞內(nèi)γH2AX表達(dá)量隨膽固醇濃度增大而增強(qiáng)。3.用NAC或絞股藍(lán)總苷預(yù)作用細(xì)胞后,免疫熒光結(jié)果顯示隨著絞股藍(lán)總苷的濃度的增大,細(xì)胞內(nèi)的γH2AX形成的焦點(diǎn)熒光強(qiáng)度逐漸減弱,與50mg/L膽固醇作用組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:Westernblot結(jié)果結(jié)果表明,細(xì)胞內(nèi)γH2AX表達(dá)量隨絞股藍(lán)總苷濃度增大而減弱,與50mg/L膽固醇作用組比