1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)早期特征性病理改變是血管內(nèi)皮功能紊亂,主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)活性下降,引起一氧化氮(Nitric oxide,NO)生成減少,造成內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙[1-4],研究表明,高膽固醇膳食可抑制內(nèi)皮依賴性血管舒張,進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂,而血漿低密度脂蛋白(low density lipoprot

2、eins,LDL)濃度的升高及氧化增加是其導(dǎo)致AS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5-7]。氧化型膽固醇(oxysterols),是膽固醇經(jīng)氧化后產(chǎn)生的一類化合物,研究發(fā)現(xiàn)7-酮膽醇(7-ketocholesterol,7-KC)在血液循環(huán)中含量很低,但在AS斑塊內(nèi)含量極高,并與AS病理損傷密切相關(guān)[8-9]。
　　 AMP激活性蛋白激酶(Adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)是

3、機(jī)體內(nèi)參與能量代謝重要的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶,主要分布于肝臟、心臟及骨骼肌中,在細(xì)胞內(nèi)以異三聚體形式存在,由一個α催化亞單位,兩個調(diào)節(jié)亞單位β和γ組成[10]。AMPK激活抑制機(jī)體內(nèi)合成代謝反應(yīng),如蛋白質(zhì)、脂肪酸、膽固醇合成等；但卻促進(jìn)體內(nèi)分解代謝,增加ATP的生成[11]。最近研究發(fā)現(xiàn),AMPK同樣存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中,并參與eNOS活性穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)及NO的生物合成,與內(nèi)皮細(xì)胞的功能密切相關(guān)[12,13]。但迄今為止,有關(guān)AMPK激活

4、對高膽固醇誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的影響及其機(jī)制未見任何報道。
　　 三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體家族(ATP-binding cassette transporter,ABC)的ABCA1和ABCG1被認(rèn)為是細(xì)胞膽固醇跨膜運(yùn)輸?shù)膬蓚€關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)子[14-16]。在轉(zhuǎn)錄水平兩者均受肝臟核受體(liverⅩ receptorα,LⅩRα)的調(diào)控[17]。在轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇方面,兩者有不同之處,ABCA1主要是促進(jìn)游離膽固醇流向不含脂的受體,如apoA

5、I或ApoE,而ABCG1更傾向于促進(jìn)膽固醇和膽固醇酯流向高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)[17-19],因此轉(zhuǎn)運(yùn)能力明顯強(qiáng)于ABCA1。此外,ABCG1能夠通過HDL介導(dǎo)促進(jìn)巨噬細(xì)胞氧化膽固醇特別是7-KC的流出[20]。這也是目前ABC家族中唯一被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)氧化膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)作用的分子。鑒于ABCG1在細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中的重要作用,以往大量的研究主要關(guān)注他在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞膽固醇平衡,抑制巨噬泡沫細(xì)胞

6、形成中的作用。近年來有研究發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮細(xì)胞中也存在ABCG1表達(dá)[21],并可通過調(diào)節(jié)氧化膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)來維持血管內(nèi)皮正常生理功能。因此如果能夠上調(diào)血管內(nèi)皮ABCG1表達(dá)將有利于保護(hù)血管功能,從而逆轉(zhuǎn)高膽固醇所致血管內(nèi)皮功能障礙,這也為AS的早期防治帶來了新的契機(jī)和研究切入點(diǎn)。
　　 研究假設(shè):
　　 AMPK可能通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞ABCG1表達(dá),介導(dǎo)膽固醇外流,緩解高膽固醇誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成及eNOS活性抑制。<

7、br>　　 實(shí)驗方法
　　 1、AMPK活化對HAECs內(nèi)ABCG1表達(dá)的影響
　　 為確定AMPK活化對ABCG1表達(dá)的影響,人體主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanaortic endothelial cells,HAECs)暴露于不同濃度AMPK(0-2mmol/L)激動劑AICAR于不同時間段(0-24h)后,分別采用Northern blot、real time RT-PCR、Western blot檢測ABCG1的表

8、達(dá)。
　　 由于AICAR是AMPK的非特異性激動劑,我們進(jìn)一步觀察了另外兩種AMPK激動劑——二甲雙胍(metformin)和A-769662對ABCG1表達(dá)的影響。將HAECs分別與二甲雙胍(1 mM)和A-769662(100μM)培養(yǎng)8 h,提取總RNA和蛋白,用real time RT-PCR和Western blot方法檢測ABCG1 mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 2、AMPK活化影響HAECs內(nèi)ABCG1 m

9、RNA表達(dá)的機(jī)制
　　 研究表明,LⅩRα在ABCG1的上游,LⅩRα的轉(zhuǎn)錄活性增加會促進(jìn)ABCG1的表達(dá)。為闡明AICAR誘導(dǎo)ABCG1表達(dá)是否依賴于LⅩRα介導(dǎo)作用,我們采用螢光素酶報道基因技術(shù)分析了LⅩRα反應(yīng)元件在此過程的作用。
　　 由于螢光素酶報道基因?qū)嶒灥年幮越Y(jié)果否定了AICAR誘導(dǎo)ABCG1表達(dá)過程中LⅩRα的特異性介導(dǎo)作用,我們推測AICAR對ABCG1 mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)可能是通過轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)機(jī)制。故

10、我們進(jìn)一步測定了AICAR作用后細(xì)胞中ABCG1 mRNA T1/2的變化。HAECs經(jīng)溶劑對照或1mmol/LAICAR處理24h后,加入放線菌素D處理不同時間以終止轉(zhuǎn)錄。然后采用Northern Blot分析ABCG1mRNA的表達(dá),并將放線菌素D處理后各時間點(diǎn)ABCG1 mRNA剩余百分?jǐn)?shù)的對數(shù)與時間作圖,并通過軟件計算ABCG1 mRNA T1/2.
　　 3、AMPK活化對HAECs內(nèi)膽固醇及7-KC外流的影響

11、　　 將HAECs單獨(dú)以膽固醇(10μg/mL)或7-KC(10μg/mL)處理,或與AICAR(0.25～2.0 mM)共同培養(yǎng)24h,PBS清洗后再與20μg/mL HDL孵育16h,然后收集細(xì)胞和培養(yǎng)液,加入膽固醇分析液后,采用熒光分光光度計檢測細(xì)胞、培養(yǎng)液中膽固醇或氧化膽固醇(7-KC)的含量。
　　 為證實(shí)在此過程中AMPK、ABCG1的特異性介導(dǎo)作用,我們分別采用AMPK抑制劑compound C及ABCG1 si

12、RNA預(yù)處理,然后觀察對AICAR誘導(dǎo)HAECs膽固醇、7-KC外流的影響。
　　 4、AMPK活化對HAECs內(nèi)氧化應(yīng)激、eNOS活性的影響
　　 通過采用carboxy-H2DCFDA(Invitrogen)檢測HAECs內(nèi)ROS水平,GSH/GSSG ratio assay kit(Caibiochem)檢測GSH/GSSG比值,NOS Assay Kit(Calbiochem)檢測eNOS活性,cyclic GM

13、P ELA KIT(Cayman chemical)檢測cGMP水平,并結(jié)合ABCG1 SiRNA技術(shù),我們觀察了1mmol/L AICAR同處理24h對7-KC(10μg/mL)誘導(dǎo)HAECs氧化應(yīng)激、eNOS活性抑制及NO生成減少的影響,并特異性評價ABCG1在此過程中的特異性介導(dǎo)作用。
　　 結(jié)論
　　 1.AMPK活化通過增NABCG1 mRNA的穩(wěn)定性特異性上調(diào)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞ABCG1 mRNA和蛋白的表達(dá)