1、要實(shí)現(xiàn)人為調(diào)控產(chǎn)蛋雞的脂質(zhì)代謝，降低雞蛋膽固醇含量，必須了解產(chǎn)蛋雞脂類(lèi)代謝和膽固醇沉積機(jī)制。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)由一磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase，AMPK)在能量代謝特別是在脂質(zhì)代謝中起著重要作用。AMPK活化可使β-羥基-β-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)等磷酸化而失去活性，從而抑制膽固醇和脂肪酸的合成。由此推測(cè)“AMPK可能介導(dǎo)產(chǎn)蛋雞膽固醇的代謝

2、”。為了初步探討AMPK是否參與產(chǎn)蛋雞膽固醇代謝的調(diào)控，本研究在建立產(chǎn)蛋雞肝臟AMPK整體活化模式的基礎(chǔ)上，考察AMPK活性變化對(duì)產(chǎn)蛋雞膽固醇代謝、雞蛋中膽固醇沉積的調(diào)節(jié)作用及對(duì)產(chǎn)蛋雞內(nèi)分泌激素的影響；同時(shí)研究AMPK是否參與介導(dǎo)調(diào)節(jié)雞蛋膽固醇沉積的物質(zhì)—洛伐他汀的降膽固醇作用。研究包括四個(gè)試驗(yàn)： 試驗(yàn)一：考察二甲雙胍(metformin)是否與AMPK的激活劑—AICAR有相似作用，可作為產(chǎn)蛋雞肝細(xì)胞AMPK的激活劑，為產(chǎn)蛋雞

3、AMPK整體活化做準(zhǔn)備。以產(chǎn)蛋雞肝細(xì)胞為材料，研究添加AICAR和二甲雙胍對(duì)產(chǎn)蛋雞肝細(xì)胞AMPK、HMGR、ACC和細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響。加入油酸鈉為脂質(zhì)合成底物。采用單因子設(shè)計(jì)，分為4個(gè)處理，分別為基礎(chǔ)培養(yǎng)液(對(duì)照組)，基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入0.5mmol/LAICAR、0.5mmol/L二甲雙胍和1.0mmol/L二甲雙胍，培養(yǎng)時(shí)間100min。結(jié)果表明： 1、二甲雙胍具有與AICAR相似的作用，0.5mmol/L、1.0mmol/L

4、二甲雙胍組AMPK活性分別較對(duì)照組提高37.4％(P＜0.05)和99.2％(P＜0.01)。二甲雙胍活化AMPK后，可抑制ACC和HMGR的活性。AMPK與ACC、HMGR活性呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.696(P=0.01)和-0.317(P=0.162)。 2、加入二甲雙胍可抑制產(chǎn)蛋雞肝細(xì)胞甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)的合成，AMPK活性與肝細(xì)胞甘油三酯、總膽固醇的合成量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.448(P=0

5、.032)和-0.493(P=0.017)。 根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，二甲雙胍能激活產(chǎn)蛋雞肝細(xì)胞AMPK。 試驗(yàn)二：考察在日糧中添加二甲雙胍(以鹽酸二甲雙胍形式)能否激活產(chǎn)蛋雞肝臟AMPK，確定適宜的添加量，為產(chǎn)蛋雞整體活化肝臟AMPK奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)選用高產(chǎn)新羅曼產(chǎn)蛋雞40只分為4個(gè)處理，即基礎(chǔ)日糧組(對(duì)照組)、基礎(chǔ)日糧中分別添加0.6％、0.8％、1.0％的鹽酸二甲雙胍(metformin-HCl)。

6、每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只雞。正式試驗(yàn)期3周。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每個(gè)處理組隨機(jī)選出5只雞剖殺，取樣測(cè)定肝臟AMPK、ACC、HMGR活性及肝臟甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量。結(jié)果表明： 1、日糧中添加0.6％、0.8％、1.0％的鹽酸二甲雙胍分別提高產(chǎn)蛋雞肝臟中AMPK活性24.3％(P＞0.05)、52.6％(P＜0.01)、57.6％(P＜0.01)；不同程度抑制了ACC和HMGR活性；肝臟中甘油三酯和總膽固醇的含量降低

7、。 2、日糧中添加鹽酸二甲雙胍降低產(chǎn)蛋雞采食量、體重、產(chǎn)蛋率；隨添加量增加降低幅度增加。 3、考慮對(duì)產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能的影響，確定日糧中添加0.8％鹽酸二甲雙胍為整體活化產(chǎn)蛋雞肝臟AMPK的適宜添加量。 本試驗(yàn)表明，日糧中添加鹽酸二甲雙胍可活化產(chǎn)蛋雞肝臟AMPK，適宜添加量為0.8％。 試驗(yàn)三：在建立產(chǎn)蛋雞肝臟AMPK活體活化模型的基礎(chǔ)上，深入研究AMPK活化后對(duì)產(chǎn)蛋雞膽固醇代謝的調(diào)控作用，對(duì)雌二醇、胰島素的

8、影響以及對(duì)雞蛋中膽固醇含量的影響。采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用高產(chǎn)新羅曼產(chǎn)蛋雞30只分為3個(gè)處理，即基礎(chǔ)日糧組、添加0.8％鹽酸二甲雙胍和配對(duì)組(飼喂基礎(chǔ)日糧，采食量按0.8％鹽酸二甲雙胍組給予)。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只雞。正式試驗(yàn)期3周。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每個(gè)處理隨機(jī)選出5只雞進(jìn)行空腹翅靜脈采血，測(cè)定血清脂質(zhì)、血糖、胰島素和雌二醇的含量，然后剖殺取樣測(cè)定肝臟AMPK、ACC、HMGR活性及肝臟中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量，測(cè)定

9、第7、14、21天雞蛋膽固醇含量。結(jié)果表明： 1、日糧中添加0.8％鹽酸二甲雙胍可顯著提高產(chǎn)蛋雞肝臟AMPK活性(P＜0.01)，配對(duì)試驗(yàn)檢驗(yàn)表明，引起AMPK活性升高的主要原因是藥物效應(yīng)，而不是采食量下降，建立的AMPK活化模型是可靠的。 2、產(chǎn)蛋雞肝臟中AMPK被活化后，肝臟中甘油三酯、總膽固醇含量分別下降39.15％(P＜0.01)、6.81％(P＞0.05)；血清中甘油三酯、總膽固醇、VLDL含量分別下降59.6

10、3％(P＜0.01)、14.23％(P＞0.05)、21.96％(P＜0.05)。 3、產(chǎn)蛋雞肝臟中AMPK被活化后，雞蛋膽固醇含量顯著下降。與基礎(chǔ)日糧組相比，按每克蛋黃膽固醇含量(mg/g蛋黃)計(jì)，第1、2、3周分別下降6.80％(P＜0.01)、6.80％(P＜0.01)、8.73％(P＜0.01)；按全蛋膽固醇含量(mg/蛋黃)計(jì)，第1、2、3周分別下降8.59％(P＜0.05)、11.77％(P＜0.01)和11.66％

11、(P＜0.01)。 4、產(chǎn)蛋雞肝臟中AMPK被活化后，胰島素較配對(duì)組降低42.68％(P＜0.01)；雌二醇含量較配對(duì)組差異不顯著(P＞0.05)。 試驗(yàn)結(jié)果初步表明，AMPK可調(diào)節(jié)產(chǎn)蛋雞膽固醇代謝。 試驗(yàn)四：考察AMPK是否具有介導(dǎo)調(diào)節(jié)產(chǎn)蛋雞膽固醇含量的物質(zhì)-洛伐他汀的調(diào)脂作用，包括動(dòng)物試驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)。動(dòng)物試驗(yàn)主要考察洛伐他汀對(duì)產(chǎn)蛋雞膽固醇的調(diào)節(jié)作用及肝臟AMPK活性的變化。設(shè)基礎(chǔ)日糧組和0.06％洛伐他汀組。

12、選用高產(chǎn)新羅曼產(chǎn)蛋雞20只，分為2個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只雞。正式試驗(yàn)期3周，測(cè)定指標(biāo)同試驗(yàn)三。細(xì)胞培養(yǎng)通過(guò)加入AMPK的抑制劑Br8-AMP，考察AMPK是否介導(dǎo)洛伐他汀的降脂作用。以產(chǎn)蛋雞肝細(xì)胞為材料，分為3個(gè)處理，即基礎(chǔ)培養(yǎng)液(對(duì)照組)、基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入0.3mmol/L洛伐他汀、基礎(chǔ)培養(yǎng)液中同時(shí)加入0.3mmol/L洛伐他汀和0.5mmol/LBr8-AMP。培養(yǎng)液中加入油酸鈉為脂質(zhì)合成底物，培養(yǎng)時(shí)間100min。

13、結(jié)果表明： 1、日糧中添加0.06％洛伐他汀能顯著降低雞蛋膽固醇含量(P＜0.01)，不影響產(chǎn)蛋雞生長(zhǎng)性能。 2、日糧中添加0.06％洛伐他汀，產(chǎn)蛋雞肝臟AMPK活性增高5.69％(P＞0.05)，HMGR活性降低21.89％(P＜0.01)，ACC活性降低9.72％(P＞0.05)。 3、細(xì)胞培養(yǎng)液中加入0.3mmol/L洛伐他汀，產(chǎn)蛋雞肝細(xì)胞AMPK活性提高4.78％(P＞0.05)；在0.3mmol/L洛伐

14、他汀組中加入0.5mmol/LBr8-AMP時(shí)，AMPK活性較洛伐他汀組降低4.57％(P＞0.05)。 試驗(yàn)表明，在不影響產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋性能的基礎(chǔ)上，洛伐他汀能極顯著降低每克蛋黃膽固醇含量及全蛋總膽固醇含量；洛伐他汀的降膽固醇作用可能部分由AMPK介導(dǎo)。通過(guò)上述體外和體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明：在日糧中添加鹽酸二甲雙胍可作為整體活化產(chǎn)蛋雞肝臟AMPK的一種方式；肝臟AMPK活化，抑制ACC和HMGR活性，影響脂肪酸和膽固醇的合成，降低雞蛋中