1、研究背景:
　　 異氟烷是一種廣泛應(yīng)用于臨床的吸入麻醉藥，雖然其具體作用機制還有待于進一步研究，目前普遍認為其主要通過激活（或增強）中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的γ-氨基丁酸A（GABAA）受體和甘氨酸（gly）受體的功能發(fā)揮作用。發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)正處于神經(jīng)發(fā)生與突觸形成的高峰時期，在此期間神經(jīng)系統(tǒng)的生長分化易受到各種干擾因素的影響。由于全身麻醉藥物以中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為其作用靶器官，因而近年來全身麻醉藥對發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育是否存在毒性作用正

2、逐漸引起廣泛關(guān)注。
　　 Γ-氨基丁酸（GABA）是腦內(nèi)最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，可分為GABAA、GABAB、GABAC等三種受體亞型。GABAA受體廣泛分布于大腦皮層、丘腦內(nèi)外側(cè)膝狀體、海馬、杏仁、丘腦、黑質(zhì)、導(dǎo)水管周圍黑質(zhì)和小腦，是一種配體門控的氯離子通道受體，主要介導(dǎo)突觸后抑制從而發(fā)揮抗焦慮、鎮(zhèn)靜和抗驚厥作用。GABAA受體在出生時即有表達并具備功能，而GABAB、GABAC受體則在出生后7-14天才逐漸發(fā)育并具備功能

3、。GABAA受體被激動后，由其門控的氯離子通道開放，其通道內(nèi)Cl-流動的方向取決于細胞內(nèi)外的Cl-濃度差。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育高峰期（胚胎晚期至出生后2周），未成熟神經(jīng)元胞膜上Na+-K+-2Cl-同向轉(zhuǎn)運體NKCC1高度表達，隨后表達逐漸降低，NKCC1可將一個Na+、一個K+和2Cl-轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)，造成神經(jīng)元胞漿內(nèi)Cl-濃度增加。而K+-Cl-同向轉(zhuǎn)運體KCC2在此期間表達低，隨著神經(jīng)元的發(fā)育成熟表達明顯增加。KCC2逆Cl-電化

4、學(xué)梯度將K+-Cl-同向轉(zhuǎn)運出細胞，致使成熟神經(jīng)元內(nèi)Cl-濃度逐漸降低。成熟神經(jīng)元表達具有功能的AMPA受體，AMPA受體興奮可以移開阻滯于NMDA受體上的Mg2+，從而使NMDA受體Ca2+通道開放而興奮。而未成熟神經(jīng)元胞膜上缺乏具有功能的AMPA受體，其胞膜表達的GABAA受體興奮可使Cl-外流，細胞膜去極化，從而發(fā)揮與成熟神經(jīng)元上AMPA受體功能相似的作用，使Mg2+從阻滯于NMDA受體的位置移開，致NMDA受體興奮。因而與成熟神

5、經(jīng)元不同，在胚胎期和出生后早期，GABAA受體介導(dǎo)突觸后興奮效應(yīng)，在神經(jīng)元軸突的生長、神經(jīng)元之間突觸的形成以及神經(jīng)元的可塑性方面起著十分重要的作用。
　　 海馬的神經(jīng)元環(huán)路通過長時程增強或長時程抑制表現(xiàn)出很強的可塑性，從而在學(xué)習(xí)和記憶的形成過程中發(fā)揮十分重要的作用。神經(jīng)元環(huán)路的形成依賴于海馬神經(jīng)元神經(jīng)突起的發(fā)育及神經(jīng)元之間突觸的形成。海馬神經(jīng)元存在自發(fā)的特異性的鈣振蕩，此種本能的特異性的鈣振蕩對發(fā)育期神經(jīng)元神經(jīng)突生長錐的遷移、神

6、經(jīng)突的生長分化、神經(jīng)元之間突觸聯(lián)系的形成等都起著十分重要的作用。神經(jīng)元胞體的鈣振蕩機制十分復(fù)雜。研究表明，鈣振蕩由細胞外的鈣離子通過配體調(diào)控性鈣通道（如NMDA受體）或者電壓調(diào)控性鈣通道（如L型鈣通道）進入胞漿，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子使胞漿內(nèi)鈣離子濃度急劇短暫升高，而胞漿內(nèi)升高的鈣離子被位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2+-ATP酶等迅速吸收，或被位于胞漿膜上的Na+/Ca2+交換子或鈣泵泵出胞漿，從而使胞漿鈣離子濃度恢復(fù)正常水平。神經(jīng)元鈣振蕩的振幅和

7、頻率與軸突的生長錐的移行速度呈負相關(guān)。生長錐移行的物質(zhì)基礎(chǔ)是細胞骨架的重建，而胞漿Ca2+濃度短暫而瞬間的增加對細胞骨架的重建起著十分重要的作用。生長錐暫停移行時可以形成大的微管環(huán)，當(dāng)微管環(huán)碎裂展開時生長錐重新開始移行。生長錐重新啟動生長移行需要動力微管和肌動蛋白絲之間相互作用。胞漿內(nèi)的鈣振蕩通過作用于神經(jīng)鈣蛋白使肌動蛋白絲脫聚合化以保持微管環(huán)的穩(wěn)定，從而抑制生長錐的移行。研究證實，使用L-型Ca2+通道阻滯劑消除神經(jīng)元的鈣振蕩，可促進

8、神經(jīng)元軸突生長錐的生長移行；而增強鈣振蕩的振幅和頻率則可減慢生長錐的移行速率。
　　 因此本研究擬通過離體培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元，從影響神經(jīng)元鈣振蕩、神經(jīng)元存活、神經(jīng)元軸突生長分化等方面深入探討吸入麻醉藥異氟烷致發(fā)育期海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性。本研究檢驗了以下假說：⑴異氟烷可增強發(fā)育期海馬神經(jīng)元的鈣振蕩；⑵臨床安全濃度的異氟烷在安全時間內(nèi)使用并不導(dǎo)致發(fā)育期海馬神經(jīng)元凋亡；⑶臨床安全濃度的異氟烷通過增強海馬神經(jīng)元的鈣振蕩抑制神經(jīng)元軸突生長

9、錐的移行。
　　 統(tǒng)計學(xué)分析:
　　 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（`x±s）表示，采用SPSS 12.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，鈣熒光強度、MTT比色實驗中的細胞存活率、活化Caspase-3的表達、神經(jīng)元軸突的生長等采用配對t檢驗，其余結(jié)果比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究總結(jié)一、主要研究結(jié)果1．通過應(yīng)用二次頂空氣相色譜法（GC）測定培養(yǎng)基內(nèi)異氟烷濃度以構(gòu)建離體培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元的異氟

10、烷干預(yù)模型。
　　 2．通過離體原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，使用胞漿內(nèi)鈣離子熒光染色劑Fluo-4 AM在激光共聚焦顯微鏡下觀測其鈣振蕩變化，并分析其特點及機制，證實吸入麻醉藥異氟烷通過興奮GABAA受體而增強發(fā)育期海馬神經(jīng)元的鈣振蕩。
　　 3．通過研究臨床相關(guān)濃度異氟烷對發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)元軸突生長分化的影響，證實臨床濃度的異氟烷并不導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡，但可抑制軸突的生長分化。
　　 二、研究結(jié)論