1、全身麻醉藥是否導(dǎo)致發(fā)育期中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性是近年來深受關(guān)注的熱點(diǎn)問題。丙泊酚是臨床常用的靜脈麻醉藥物，具有起效迅速、作用時(shí)間短、蘇醒快、易控制和副作用少等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用小兒麻醉和重癥監(jiān)護(hù)室。但越來越多的在體或離體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，靜脈麻醉藥丙泊酚對發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性作用。丙泊酚對發(fā)育期大腦神經(jīng)毒性的機(jī)制目前仍然不清楚，其中一個(gè)可能的機(jī)制是引起了神經(jīng)元內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的絮亂。發(fā)育期神經(jīng)元有其特殊的生理特征，本研究擬通過體外培養(yǎng)的發(fā)育期神經(jīng)元，研究丙

2、泊酚對發(fā)育期皮質(zhì)神經(jīng)鈣離子的影響。實(shí)驗(yàn)主要分為兩部分：一，優(yōu)化和改進(jìn)體外培養(yǎng)的原代發(fā)育期皮質(zhì)神經(jīng)元方法，觀察和鑒定發(fā)育期神經(jīng)元，培養(yǎng)純度高、活力好的神經(jīng)元，能夠滿足下一步實(shí)驗(yàn)的要求。二，激光共聚焦顯微鏡下觀察Fluo-4 AM熒光染色后發(fā)育期皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化；檢測不同濃度的丙泊酚(10、30、100μmol/L)對大鼠發(fā)育期皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，評(píng)估丙泊酚對發(fā)育期皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞 L-型鈣離子通道的影響。
　　第一部分新

3、生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法
　　目的：建立一種穩(wěn)定、高效、簡單可行的新生大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法。
　　方法：取新生24h內(nèi)的SD大鼠，分離皮質(zhì)，采用木瓜蛋白酶消化、實(shí)驗(yàn)前多聚賴氨酸鋪板、不同機(jī)械吹打次數(shù)及細(xì)胞接種2h后全量換為添加B-27的Neurobasal A培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，MTT比色法分析檢測神經(jīng)元細(xì)胞成活率；于不同時(shí)間在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)；利用神經(jīng)元特異性標(biāo)志物微管蛋白相關(guān)標(biāo)志物2(mic

4、rotubule associated protein2,MAP2)鑒定神經(jīng)元純度。
　　結(jié)果：木瓜蛋白酶明顯增加原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞活力（P＜0.01），采用適度的機(jī)械吹打、實(shí)驗(yàn)前多聚賴氨酸鋪板及細(xì)胞接種2h后全量換為添加B-27的Neurobasal A培養(yǎng)基，對神經(jīng)細(xì)胞的活力沒有明顯的影響（P>0.05）。大部分皮質(zhì)神經(jīng)元具有典型的神經(jīng)元形態(tài)特征；經(jīng)MAP2免疫熒光技術(shù)鑒定神經(jīng)元神經(jīng)元所占比例達(dá)95％以上，能夠滿足進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)

5、要求。
　　結(jié)論：該方法操作簡單、高效、方便可行，結(jié)果穩(wěn)定。
　　第二部分丙泊酚對發(fā)育期大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元鈣離子的影響
　　目的：觀察不同濃度丙泊酚對大鼠發(fā)育期大腦皮質(zhì)神經(jīng)元鈣離子（［Ca2+］i）的影響，檢測丙泊酚對發(fā)育期皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞L-型鈣離子通道的影響。
　　方法：原代培養(yǎng)7天的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，隨機(jī)分為4組：對照組（Control組）、丙泊酚10μmol·L-1組（P10組）、丙泊酚30μmol·L-1組（P3

6、0組）、丙泊酚100μmol·L-1組（P100組）；尼非地平干預(yù)實(shí)驗(yàn)分組：對照組（Control組）、丙泊酚組（Propofol100μmol·L-1組）、尼非地平組（Nifedipine10μmol·L-1組）、丙泊酚+尼非地平組（Nifedipine(10μmol·L-1)+Propofol(100μmol·L-1)組），F(xiàn)luo-4AM鈣熒光指示劑染色,激光共聚焦顯微鏡下動(dòng)態(tài)檢測基礎(chǔ)值、丙泊酚預(yù)處理后和氯化鉀溶液誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子

7、濃度的變化。
　　結(jié)果：培養(yǎng)7天的大鼠各組皮質(zhì)神經(jīng)元基礎(chǔ)值、丙泊酚預(yù)處理各組鈣熒光強(qiáng)度間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；丙泊酚預(yù)處理后鈣熒光強(qiáng)度同基礎(chǔ)值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；氯化鉀誘發(fā)后各組鈣熒光強(qiáng)度明顯高于基礎(chǔ)值(P<0.01)；P30、P100組與Control組比較氯化鉀誘發(fā)后鈣熒光強(qiáng)度峰值明顯降低(P<0.01)，分別下降了26.3%和28.6%；P30、P100與P10組比較明顯降低(P<0.01)

8、，P10組與Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，P100與P30組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。尼非地平干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，高鉀刺激細(xì)胞鈣熒光強(qiáng)隊(duì)明顯升高(P<0.01)；丙泊酚預(yù)處理后，氯化鉀誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度峰值與對照組組比較，明顯降低(P<0.01)。尼非地平預(yù)處理神經(jīng)元25min后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度與對照組比較明顯降低(P<0.01)。尼非地平抑制高鉀導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣超載與丙泊酚預(yù)處理組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義