1、目的：內(nèi)皮功能紊亂是心腦血管病重要的病生理基礎(chǔ)。加速血管損傷后再內(nèi)皮化和血管新生，是預(yù)防及治療心血管病的關(guān)鍵。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)參與血管內(nèi)皮修復(fù)及血管新生，EPCs的歸巢、增殖及分化受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響，其機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)旨在研究新型C2H2鋅指蛋白基因ZFP580調(diào)控EPCs分化的分子機(jī)制，為深入研究ZFP580的生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為治療血管性疾病提供新

2、的治療策略和靶點(diǎn)。
　　方法：①密度梯度離心法，分離培養(yǎng)大鼠骨髓源性EPCs，免疫熒光染色及流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)鑒定EPCs；②體外誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs，觀(guān)察EPCs在0 d、4 d、7 d、14 d細(xì)胞形態(tài)的動(dòng)態(tài)改變；免疫熒光染色檢測(cè)eNOS在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)EPCs分化表面分子標(biāo)記物的動(dòng)態(tài)改變；QPCR及Western blot檢測(cè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)ZFP580 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化；③腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得

3、過(guò)（低）表達(dá)ZFP580的EPCs，QPCR、Western blot、流式細(xì)胞技術(shù)及體內(nèi)外血管形成實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè) ZFP580對(duì) EPCs分化及血管生成能力的影響；④Ad-ZFP580及Ad-siZFP580轉(zhuǎn)染EPCs，觀(guān)察ZFP580對(duì)其下游靶基因eNOS表達(dá)的影響，應(yīng)用eNOS抑制劑L-NAME，探討eNOS/NO信號(hào)通路在ZFP580介導(dǎo)的EPCs分化過(guò)程中的作用。
　　結(jié)果：分離培養(yǎng)的EPCs在3~4 d時(shí)，光學(xué)顯微鏡

4、下可見(jiàn)部分貼壁細(xì)胞集落樣生長(zhǎng)，呈圓形或不規(guī)則形；7~10 d，貼壁的梭形細(xì)胞從細(xì)胞團(tuán)邊緣出芽生長(zhǎng)；14~21 d可觀(guān)察到梭形細(xì)胞首尾相連成條索狀結(jié)構(gòu)，梭形細(xì)胞基本融合，融合后逐漸呈鋪路石狀。細(xì)胞培養(yǎng)至7 d時(shí)， Dil-acLDL/FITC-UEA-I雙陽(yáng)性細(xì)胞約占87.39±2.98％，免疫熒光及FACS結(jié)果顯示：CD31、CD34和VEGFR-2表達(dá)陽(yáng)性。以上結(jié)果說(shuō)明所培養(yǎng)細(xì)胞是EPCs。FACS檢測(cè)EPCs的分子表面標(biāo)志物的表達(dá)變

5、化，結(jié)果顯示：隨著EPCs的分化，干細(xì)胞表型CD133逐漸減低，而成熟ECs表型逐漸增高；同時(shí)，ZFP580及eNOS在EPCs的分化過(guò)程中均呈動(dòng)態(tài)表達(dá)。腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得過(guò)（低）表達(dá)ZFP580的EPCs，ZFP580過(guò)表達(dá)促進(jìn)成熟內(nèi)皮表型CD31、vWF、eNOS的表達(dá)，降低干細(xì)胞表型CD133的表達(dá)，同時(shí)，體內(nèi)外血管生成能力增強(qiáng)；而ZFP580低表達(dá)抑制成熟內(nèi)皮表型CD31、vWF、eNOS的表達(dá)，增強(qiáng)干細(xì)胞表型CD133的表達(dá)，

6、同時(shí)，體內(nèi)外血管生成能力減弱。說(shuō)明ZFP580可促進(jìn)EPCs向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化。應(yīng)用eNOS抑制劑L-NAME后，顯著降低Ad-ZFP580誘導(dǎo)的EPCs分化作用，且NO的生物利用度明顯減少，說(shuō)明ZFP580通過(guò)eNOS/NO信號(hào)途徑調(diào)控EPCs的分化。
　　結(jié)論：ZFP580通過(guò)eNOS/NO信號(hào)通路調(diào)控EPCs的分化。本實(shí)驗(yàn)在分子、細(xì)胞和個(gè)體水平上研究ZFP580調(diào)控EPCs分化促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)的分子機(jī)制，為深入研究ZFP58