1、轉基因動物研究是目前生物科學的研究熱點之一。家蠶是重要的經(jīng)濟昆蟲，更是經(jīng)典遺傳學研究的模式生物之一。進行轉基因蠶研究具有重要的理論意義和實用價值。轉基因家蠶是指用實驗導入的方法使外源基因在染色體基因組內穩(wěn)定整合，并能遺傳給下一代。轉基因家蠶的研究建立在經(jīng)典遺傳學、分子遺傳學、結構遺傳學和DNA重組技術的基礎之上。最近完成的家蠶全基因組測序工作(Xia等,2004)，將促進家蠶的基礎研究，并使家蠶作為模式昆蟲對昆蟲學科的發(fā)展起到積極的推動

2、作用。在家蠶的全基因組框架圖完成之后，目前的主要工作是對家蠶基因組計劃所獲得的大量基因進行研究，以探索其具體的生物學功能。由于轉基因技術可以實現(xiàn)家蠶功能基因的過量表達或者基因功能的缺失，因此將成為研究家蠶基因功能的重要方法之一。同時，轉基因技術也是利用功能基因開發(fā)新的蠶品種的關鍵，甚至還是實現(xiàn)利用家蠶合成有用蛋白質、開發(fā)家蠶生物反應器的技術關鍵。 本論文主要由轉基因載體構建、載體表達、細胞培養(yǎng)和篩選三個部分組成。其主要研究工作包

3、括以下幾個方面： 1.根據(jù)已報道的家蠶肌動蛋白A3基因的啟動子序列設計了引物，克隆A3啟動子。通過對蠶肌動蛋白A4基因的分析，設計了3對引物：A4-1，A4-2，A4-3，最終將A4-2克隆到轉基因載體中，能夠成功啟動基因的表達。 2.以家蠶Bombyxmori肌動蛋白(actin3，A3)啟動子、增強性綠色熒光蛋白基因EGFP及SV40的多聚腺苷酸識別序列為元件，經(jīng)多次克隆，將其插入到piggyBac轉座載體中。經(jīng)PC

4、R、酶切鑒定及測序表明各元件已按正確的方式插入到piggyBac載體中。將構建好的piggyBac表達載體通過細胞轉染進入家蠶BME細胞中，48小時后觀察到發(fā)紅色熒光的培養(yǎng)細胞，通過分子水平檢測，能在轉染細胞cDNA中闊增到EGFP片段，結果表明該載體構建正確且能在細胞中進行表達。 3.以家蠶BombyxmoriA4啟動子、紅色熒光蛋白基因RFP及SV40的多聚腺苷酸識別序列為元件，經(jīng)多次克隆，將其插入到piggyBac轉座載體

5、中。經(jīng)PCR、酶切鑒定及測序表明各元件已按正確的方式插入到piggyBac載體中。將構建好的piggyBac表達載體通過細胞轉染進入SF21細胞中，48小時后觀察到發(fā)紅色熒光的培養(yǎng)細胞，在48～72小時發(fā)紅色熒光細胞數(shù)達到最大。通過分子水平檢測，能在轉染細胞cDNA中闊增到dsRed片段，結果表明該載體構建正確且能在細胞中進行表達。 4.細胞轉染條件優(yōu)化：脂質體的量在1～4ul時，轉染效率逐漸增高，在4ul時最大，進一步加大到8

6、ul，細胞死亡嚴重，效果較差；DNA的量在0.8～1.2ug時轉染效果較好，0.4ug時轉染效率較低，DNA量增加到1.6～2.0ug，對轉染效率影響不大。綜合脂質體和DNA的用量，當脂質體為4ul，DNA在0.8～1.2ug時，轉染效率達到最高，此條件為最優(yōu)。 5.家蠶pBacA4Rfp轉基因載體穩(wěn)定表達：家蠶pBacA4Rfp轉基因載體穩(wěn)定表達較瞬時表達不同，是在轉染細胞時加入了轉座酶A3H，期望piggyBac能定向的把目

7、的基因轉座到細胞基因組中，通過復制分裂，使基因在下一代中也能表達。實驗證明，pBacA4Rfp轉基因載體在轉座酶A3H的作用下，將外源DNA正確的插入到細胞基因組中，表達蛋白并且能夠穩(wěn)定的傳給下一代。經(jīng)過長時間的觀察記錄(轉染后6個月)，確定細胞一直能夠穩(wěn)定地表達紅色熒光蛋白，說明細胞能持續(xù)發(fā)光并能傳代。至本論文完稿，轉基因細胞一直在做繼代培養(yǎng)，且能檢測到紅色熒光。 簡而言之，本實驗通過載體構建，并利用脂質體介導法轉染家蠶胚胎細