1、家蠶既是支撐蠶絲產(chǎn)業(yè)的生物基礎(chǔ)，又是鱗翅目昆蟲研究的典型模式種類，同時(shí)，也是開發(fā)新一代生物反應(yīng)器和新型昆蟲產(chǎn)業(yè)的材料。近幾年來對其的科學(xué)研究所取得的成果具有較高的學(xué)術(shù)價(jià)值，代表了國際同領(lǐng)域的先進(jìn)水平，特別是在遺傳連鎖圖譜、家蠶基因組序列與結(jié)構(gòu)等方面，使得結(jié)構(gòu)基因組學(xué)開始過渡到了功能基因組學(xué)。在家蠶中基因功能的研究方法很多，轉(zhuǎn)基因技術(shù)不乏為一個(gè)很優(yōu)秀的手段。本文就有關(guān)基因功能研究中的家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)和方法開展了一些研究工作，主要的研究內(nèi)容和

2、得到的結(jié)果如下：
　　 1、家蠶轉(zhuǎn)基因效率與轉(zhuǎn)座子內(nèi)部序列的相關(guān)分析
　　 自從基于piggyBac轉(zhuǎn)座子方法的家蠶轉(zhuǎn)基因成功問世以來，越來越多的研究學(xué)者利用該項(xiàng)技術(shù)來進(jìn)行家蠶生物反應(yīng)器和家蠶具有潛在經(jīng)濟(jì)性能的功能基因研究。然而該項(xiàng)技術(shù)的顯微注射費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且成功率僅在3％～5％之間，不利于它的大規(guī)模推廣與應(yīng)用。為了提高家蠶轉(zhuǎn)基因成功率，我們piggyBac轉(zhuǎn)座子載體進(jìn)行了改造，敲除了載體中的冗余序列，構(gòu)建得到了四種不同

3、左右臂長度組合的轉(zhuǎn)座子，分別進(jìn)行了細(xì)胞水平和轉(zhuǎn)基因家蠶水平的檢測，其中左臂長333 bp、右臂長179 bp的轉(zhuǎn)座子效率最高，經(jīng)多次轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，此種載體能將家蠶轉(zhuǎn)基因效率提高2～7倍，更有利于開展家蠶轉(zhuǎn)基因的研究。
　　 2、家蠶hsp70啟動(dòng)子的克隆及功能研究
　　 通過PCR的方法克隆得到家蠶熱激蛋白70基因(Bombyx mori hsp70)的5’側(cè)翼的兩個(gè)長度分別為538 bp和305 bp的序列hsp70

4、-538和hsp70-305。生物信息分析結(jié)果表明這兩段序列在TATA序列的上游存在保守的熱激元件(Heat Shock Element，HSE)CTnGAAnnTTCnAG。采用雙熒光報(bào)告基因技術(shù)研究表明這兩段序列在BmN細(xì)胞中都表現(xiàn)出熱激活性，轉(zhuǎn)基因家蠶實(shí)驗(yàn)證明hsp70-305在家蠶個(gè)體中也具有熱激活性，可以認(rèn)為這兩個(gè)片段具有hsp70熱激啟動(dòng)子特性，便于在家蠶中進(jìn)行條件誘導(dǎo)的研究。
　　 3、IRES在家蠶表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)

5、用
　　 通過化學(xué)合成的方法得到了來源于豬腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus，EMCV)和禾谷縊管蚜蟲病(Rhopalosiphum padi virus，RhPV)的四種不同長度的的內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列(Internal Ribosome Entry Site，IRES)IRES，并將它們構(gòu)建到pFastBac雙熒光載體中，通過Bac-to-Bac的方法得到了相應(yīng)的重組病毒后，在細(xì)胞及家蠶的3個(gè)組織

6、中比較了它們的活性，結(jié)果顯示IRES593的活性最高，家蠶組織中以中部絲腺的活性最高，其次是脂肪體和后部絲腺。
　　 4、啟動(dòng)子陷阱在家蠶基因功能研究應(yīng)用中的技術(shù)探討
　　 啟動(dòng)子陷阱是一種高通量、既能制造突變體同時(shí)又能得到被突變基因序列的研究方法，在陷阱系統(tǒng)的設(shè)計(jì)上我們綜合了如上所述的3點(diǎn)成果，構(gòu)建得到了兩種轉(zhuǎn)基因家蠶，一種是分別由hsp70、A3啟動(dòng)子控制表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的家蠶pBhsp70transposase3xP3E

7、GFP和pBA3transposase3xP3EGFP，另一種是帶有檢測基因EGFP的啟動(dòng)子陷阱家蠶。根據(jù)我們的初步研究結(jié)果表明：第一，由組成型啟動(dòng)子A3控制表達(dá)的轉(zhuǎn)座酶能更有效地啟動(dòng)家蠶中轉(zhuǎn)座子的再轉(zhuǎn)座；第二，由于轉(zhuǎn)座臂內(nèi)可能殘留有piggyBac轉(zhuǎn)座酶啟動(dòng)子，因此陷阱中報(bào)告基因的方向應(yīng)與原始轉(zhuǎn)座酶的方向相反。
　　 5、piggyBac轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)特性的分析
　　 為更好的利用piggyBac轉(zhuǎn)座子，本文還分析了p