1、病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)技術(shù)已在植物基因功能研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。為了將煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)應(yīng)用于對(duì)大豆基因的功能研究，本試驗(yàn)建立了以TRV為載體介導(dǎo)的大豆基因瞬時(shí)沉默體系，并利用該體系對(duì)大豆中與大豆抗大豆花葉病毒(SMV)相關(guān)的胼胝質(zhì)合酶基因(GmCalS7)和與大豆抗鹽性相關(guān)的Na+-H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（G

2、mNHX1/GmNHX5）進(jìn)行了功能分析。試驗(yàn)獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.選用大豆八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)基因?yàn)闃?biāo)記基因，首先構(gòu)建了該基因的沉默載體TRV∶GmPDS，向大豆葉片注射攜帶有TRV∶GmPDS的農(nóng)桿菌，在注射后第25天，上部未接種病毒的葉片出現(xiàn)了白化現(xiàn)象，通過半定量RT-PCR分析，發(fā)生白化的植株中GmPDS基因被有效沉默。
　　2.向大豆葉片注射攜帶有TRV的農(nóng)桿菌后再接種SMV，發(fā)現(xiàn)先接種TRV對(duì)大豆

3、接種SMV的抗性表現(xiàn)沒有影響。
　　3.構(gòu)建了GmCalS7基因的沉默載體TRV∶GmCalS7，向大豆葉片注射攜帶有TRV∶GmCalS7的農(nóng)桿菌，以注射只攜帶TRV的農(nóng)桿菌作對(duì)照，在注射后第25天:
　　1)取第二輪復(fù)葉做半定量RT-PCR分析，注射TRV∶GmCalS7的植株中GmCalS7被有效沉默。
　　2)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株接種大豆花葉病毒(SMV)株系N3，在接種SMV后96h，在熒光顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的胼

4、胝質(zhì)。GmCalS7沉默植株的胼胝質(zhì)較對(duì)照植株明顯減少。
　　3)轉(zhuǎn)基因植株接種SMV株系N3的當(dāng)位葉均能檢測(cè)到SMV的外殼蛋白基因CP的表達(dá)，在GmCalS7沉默植株的未接種上位葉片中也能夠檢測(cè)到極微量CP，而對(duì)照組植株未檢測(cè)到CP。結(jié)果表明，GmCalS7沉默后，胼胝質(zhì)合成減少，N3病毒向上位葉傳播。
　　4.構(gòu)建GmNHX1基因和GmNHX5基因的沉默載體TRV∶GmNHX1和TRV∶GmNHX5，采用水培方法分別向大

5、豆根部接種攜帶TRV∶ GmNHX1或TRV∶GmNHX5的農(nóng)桿菌，以接種TRV為對(duì)照，在接種病毒后的第7天:
　　1)取第一位真葉做半定量RT-PCR分析，接種TRV∶GmNHX1或TRV∶GmNHX5的植株中GmNHX1基因和GmNHX5的表達(dá)量較對(duì)照明顯降低，表明GmNHX1和GmNHX5基因被有效沉默。
　　2)以200 mmol/L濃度的NaCl對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鹽處理，處理后1h，GmNHX1或GmNHX5沉默植株