1、自1998年在線蟲中發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象以來的10余年間，利用RNAi手段研究基因功能已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種物種中。隨著對RNAi機制的解析，研究者們發(fā)現(xiàn)參與這種保守機制的蛋白在不同的物種中其實不完全相同，并且其中還有很多蛋白的功能沒有得到詮釋。Tudor-SN(TSN)蛋白就是其中之一，雖然是最早被發(fā)現(xiàn)的沉默復(fù)合體(RISC)成員蛋白，但其功能至今為止仍然不清楚。TSN蛋白具有保守的4個完整的SN結(jié)構(gòu)域，一個Tudor結(jié)構(gòu)域以及一個含部分序列

2、的第五SN結(jié)構(gòu)域，保守存在于各物種中。該蛋白在不同的生物體內(nèi)參與不盡相同的調(diào)控途徑，且在同一物種中往往具有多種功能，如：參與激活轉(zhuǎn)錄因子、mRNA剪切、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、降解被修飾的miRNA等。TSN復(fù)雜的結(jié)構(gòu)決定了其作為多功能蛋白參與不同途徑。
　　 對于鱗翅目昆蟲的代表家蠶而言，RNAi也是研究其基因功能的有力工具之一，但是關(guān)于家蠶干涉途徑機制解析的報道卻很少。本研究以家蠶TSN為對象，通過克隆該基因的CDS，分析了其預(yù)測氨基酸

3、序列特征；采用免疫染色對其進行亞細胞定位；在家蠶細胞中利用熒光雙分子互補實驗驗證家蠶TSN蛋白和AGO1以及AGO2蛋白的相互作用；構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達環(huán)狀熒光素酶細胞系來檢測降低tsn基因的表達是否引起caspase3介導(dǎo)的細胞凋亡。在此基礎(chǔ)上，對tsn基因進行瞬時干涉檢測其在家蠶RNAi途徑中的作用，同時構(gòu)建轉(zhuǎn)基因過量表達tsn基因的細胞系檢測其是否有助于提高干涉效率。主要的結(jié)果如下：
　　 1.家蠶tsn基因的序列分析以及表達特

4、征分析
　　 克隆獲得的家蠶tsn基因cDNA序列為3362bp，其中包括2667bp的ORF，186bp的5'UTR和509bp的3'UTR。ORF編碼含888個氨基酸的蛋白，分子量為98.88kD，等電點為8.55。該蛋白包含4個完整的SN結(jié)構(gòu)域，一個含部分序列的SN結(jié)構(gòu)域以及一個Tudor結(jié)構(gòu)域，其中在Tudor結(jié)構(gòu)域中包含5個決定其芳香籠狀結(jié)構(gòu)的保守氨基酸殘基。對TSN蛋白質(zhì)氨基酸序列進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)家蠶的TSN蛋白

5、氨基酸序列與果蠅、線蟲和人類分別具有52％、51％和43％的相同性，分別具有70％、67％和63％的相似性。通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)家蠶tsn基因在檢測的家蠶10個組織中都有表達，主要在精巢，卵巢以及絲腺中有較高量的轉(zhuǎn)錄，相反，在血液和馬氏管中的表達量相對較少。通過免疫染色發(fā)現(xiàn)，家蠶tsn基因主要在BmN4細胞的細胞質(zhì)中表達。
　　 2.家蠶TSN與AGO1和AGO2之間的相互作用
　　 在家蠶細胞中利用熒光雙分子互補實驗(

6、BiFC)驗證家蠶TSN蛋白和AGO1以及AGO2蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)家蠶TSN蛋白和AGO1以及AGO2蛋白在細胞質(zhì)中形成復(fù)合體，這個復(fù)合體可能存在于某個細胞器中。由于AGO1和AGO2在P-boby中參與mRNA翻譯抑制，結(jié)合本實驗研究結(jié)果，我們推測TSN可能在P-body中協(xié)助AGO1和AGO2參與mRNA翻譯抑制。
　　 3.家蠶BmN4細胞內(nèi)RNA編輯與RNA干涉途徑之間的拮抗作用分析
　　 最近的報道表明一些

7、物種中A到I的RNA編輯對RNA干涉途徑具有抑制作用。被RNA編輯酶ADAR修飾后的dsRNA不能進入RNA干涉途徑，而被ADAR修飾后的dsRNA會被TSN蛋白結(jié)合并降解。家蠶基因組中也存在adar基因，通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)家蠶adar基因主要在頭和表皮中有表達。在家蠶細胞中我們通過干涉adar和tsn基因，以熒光素酶基因為報道基因檢測干涉效率，發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染72小時后，干涉了adar和tsn基因后并沒有影響干涉效率。這表明在我們的實驗條

8、件下，RNA編輯對RNA干涉途徑并沒有明顯的拮抗作用。
　　 4.抑制家蠶adar基因和tsn基因后對家蠶BmN4細胞引起的凋亡檢測
　　 由于考慮到ADAR蛋白的修飾作用以及TSN蛋白作為一種多功能蛋白為生物體或者是細胞生存所必須，再者，已有研究發(fā)現(xiàn)沉默了挪威云杉tsn基因表達后會引起植物細胞異常的細胞死亡并影響其植物體的繁殖力，因此干涉這兩個基因后可能會引起細胞凋亡。所以我們構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達環(huán)狀熒光素酶的細胞系來檢測c

9、aspase3引起的細胞凋亡。但結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抑制adar和tsn基因后，從細胞形態(tài)上以及分子水平上與過量表達人p53基因的陽性對照比較都沒有發(fā)現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象。
　　 5.抑制與過量表達家蠶tsn基因?qū)倚QBmN4細胞中干涉效率的影響分析
　　 采用瞬時干涉檢測的方法，即在轉(zhuǎn)染雙鏈RNA后24到48小時內(nèi)檢測干涉效率，利用不同劑量的tsn基因?qū)?yīng)的dsRNA轉(zhuǎn)染36小時后發(fā)現(xiàn)，2.5ng到40ng的dsRNA劑量之間報告基

10、因的表達量逐漸升高，說明干涉效率逐漸下降。而80ngdsRNA處理后干涉效率反而有所提高。我們推測，前者是由于干涉掉tsn基因而影響到了干涉效率，后者是由于dsRNA劑量太高而產(chǎn)生的非特異干涉現(xiàn)象。同時，我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因過量表達tsn基因的細胞系，并且比較了這種細胞系和正常細胞的干涉效率，發(fā)現(xiàn)干涉效率并沒有因為tsn基因的過量表達而升高。
　　 綜上所述，本研究在細胞水平上，通過亞細胞定位鑒定出家蠶tsn基因在細胞質(zhì)中表達；通過

11、熒光雙分子實驗驗證出家蠶TSN蛋白和AGO1以及AGO2蛋白之間分別相互作用；構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達環(huán)狀熒光素酶的細胞系檢測干涉，并發(fā)現(xiàn)干涉家蠶adar基因和tsn基因后并不能引起caspase3介導(dǎo)的細胞凋亡；同時以熒光素酶為報告基因檢測A到I的RNA編輯是否對RNAi途徑具有拮抗作用，研究發(fā)現(xiàn)BmN4細胞中RNA編輯對RNAi途徑的拮抗作用并不明顯；為了詳細研究TSN在家蠶RNAi途徑中的作用，我們采取瞬時干涉檢測的方法發(fā)現(xiàn)TSN在家蠶RN