1、背景：慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)是一種亟待解決的全球性公共健康問題，而心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)是影響慢性腎臟病預后的主要因素。我國透析患者CVD的死亡率為47％，是導致慢性腎衰竭患者死亡的第一位原因。慢性腎衰的心血管并發(fā)癥主要包括左室肥厚(Left ventricular hypertrophy，LVH)和擴張、心肌缺血和外周血管疾病。幾乎所有的終末期腎臟

2、病患者都合并有CVD，必須引起重視的是，CVD并非僅見于終末期腎臟病患者，事實上LVH在CKD早期就已經(jīng)普遍出現(xiàn)了，而進展至ESRD時幾乎全部患者都存在LVH。LVH是確認存在心血管終末器官損害的指標之一。腎損傷是CKD患者出現(xiàn)臨床癥狀的直接原因，同時還能夠通過神經(jīng)體液調節(jié)路徑的持續(xù)激活引起左室收縮功能障礙、心臟灌注壓升高和心室擴張等心血管并發(fā)癥。CKD中存在的刺激因素主要包括交感神經(jīng)系統(tǒng)的高反應性、腎素血管緊張素系統(tǒng)的激活、一氧化氮和

3、活性氧簇的平衡紊亂和慢性炎癥狀態(tài)的維持，這些在CVD的發(fā)生發(fā)展中起到了非常重要的作用。另外，CVD也可以直接作用于腎臟，通過減少腎臟灌注和腎動脈硬化來促進慢性腎臟病的發(fā)生和發(fā)展。 CVD是慢性腎臟病患者病程進展與死亡的主要原因，而高血壓是CKD患者中CVD發(fā)生的顯著性獨立危險因素。美國國家腎臟基金會腎臟疾病預后質量計劃提示，CKD患者普遍存在高血壓。無論是作為引起CKD的原因還是CKD的結果，高血壓都是決定腎功能水平的非常重要的獨立危險

4、因素。來自人類與動物的流行病學、干預與遺傳病學的研究明確指出了血壓依賴于鹽攝入的關系。鹽敏感個體相對鹽抵抗個體更容易出現(xiàn)心血管系統(tǒng)的并發(fā)癥，且都獨立于傳統(tǒng)的心血管危險因素。長期高鹽攝入增加會引起明顯的血壓升高反應，同時也會加重高血壓引起的終末器官結構和功能損害，并且這一損害并非單單由血壓升高引起?；谛呐K對高鹽攝入反應的實驗研究，發(fā)現(xiàn)高鹽能引起動脈血壓升高，同時能夠引起血管纖維化、心室缺血和收縮功能障礙。蛋白質組學是研究蛋白的復雜性、用

5、途和生物特性的技術，是以蛋白的生物多樣性為基礎，包括蛋白亞型、翻譯后修飾（以磷酸化修飾為主）等。心臟蛋白質組學已經(jīng)成為解開心血管疾病中存在的信號通路的不可缺少的技術，很多重要的心血管功能如鈣平衡、心臟收縮和細胞信號轉導都是通過蛋白的磷酸化與去磷酸化實現(xiàn)的。蛋白磷酸化信號途徑的紊亂與多種心血管疾病（如心臟肥厚、缺血再灌注損傷）相關，而且蛋白質磷酸化信號分子還被作為心血管藥物的靶點。盡管心血管并發(fā)癥在慢性腎臟病中的重要性被廣泛認識，但是相關

6、的分子機制尚不完全清楚。本研究旨在利用磷酸化蛋白質組學的技術對慢性腎衰大鼠中心臟磷酸化蛋白進行定性和定量研究以及觀察給予高鹽飲食后心臟蛋白的磷酸化水平的改變，從而為探索慢性腎臟病中并發(fā)的心血管疾病的機制提供線索。
　　 方法：⑴雄性Sprague Dawley大鼠（購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心），體重150-180g，在SPF級環(huán)境飼養(yǎng)（南方醫(yī)院實驗動物中心），自由進水和飲食。⑵大鼠體重200g左右行左側腎臟2/3切，一周后進行

7、右側腎全切（完全保留雙側的腎上腺），假手術大鼠只進行腎包膜剝離。造模期間，分別在術后4周、8周和10周通過眼眶靜脈采血，檢測大鼠血肌酐水平。⑶給予不同濃度鹽飼料刺激的最后三天，代謝籠內單只單籠飼養(yǎng)，連續(xù)三天收集24h尿液，記錄總尿量后，留取4ml尿樣。并測量尾動脈血壓。⑷以3％戊巴比妥鈉(35mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血后迅速打開胸腔，16#灌胃針從左心室穿刺入主動脈，同時剪開右心耳，4℃預冷的生理鹽水（含肝素20U/ml

8、）200ml快速灌注。⑸200ml預冷生理鹽水灌注完畢后立即分離心臟，稱重后去除心房和右心室，取左心室游離壁組織PBS反復清洗后包于錫箔紙中，液氮速凍，-80℃保存。⑹所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復實驗的結果，以均數(shù)±標準誤表示，所有統(tǒng)計分析由統(tǒng)計軟件SPSS13.0完成。兩種樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗;方差齊的多種樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA，兩兩比較采用LSD法，方差不齊的多種樣本均數(shù)的比較采用Welch法，兩兩比較

9、采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。⑺每組取等量肽段(約80ug)，按照試劑盒:iTRAQ Reagent-4plex Multiplex Kit(AB SCIEX)說明書進行標記，重復標記1次。將標記后的肽段溶液混合，取1/10體積的混合肽段脫鹽，然后進行質譜分析。取剩余的9/10體積混合肽段真空凍干，凍干后用于二氧化鈦富集。⑻標記后的混合肽段溶液真空凍干，加入1×DHB buffer復溶。溶液中加入Ti0

10、2 beads，振蕩40min，離心，移去上清液。將beads轉入具塞tip頭中，加入Washing buffer1洗滌三次，加入Washing buffer2洗滌三次。加入Elution buffer洗脫，收集磷酸化肽段，真空濃縮，用20μL0.1％ FA溶解，取10μL用于質譜分析。⑼樣品經(jīng)毛細管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質譜儀(ThermoFinnigan)進行質譜分析。⑽質譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW文件，用軟件Masc

11、ot2.2和ProteomeDiscoverer1.3(Thermo Scientific)進行查庫鑒定及定量分析。⑾查庫使用Mascot軟件版本為Mascot2.2。查庫時將RAW文件通過Proteome Discoverer提交至Mascot服務器，選擇已經(jīng)建立好的數(shù)據(jù)庫，然后進行數(shù)據(jù)庫搜索。⑿Proteome Discoverer1.3軟件根據(jù)肽段報告離子峰強度值進行定量分析。肽段定量結果為參考樣品所在標簽的信號強度值與其他標簽的

12、信號強度值的比值。蛋白質定量結果為鑒定肽段定量結果的中位數(shù)。最終定量結果再以各標簽比值中位數(shù)進行歸一化處理，以消除實驗中人為因素引入的上樣量誤差。⒀質譜數(shù)據(jù)由Mascot軟件搜索后，再由Proteome Discoverer1.3軟件對磷酸化肽段進行分析(Phospho RS score，Phosphop RS sequence probability，PhosphoRS site probabilities), Phospho RS

13、score大于50分，Phospho RS site probabilities大于75％說明磷酸化修飾的可信度較高。
　　 結果：⑴大鼠造模后第9周，測量血壓，稱重并采集大鼠血液測定血肌酐水平，發(fā)現(xiàn)慢性腎衰大鼠與假手術組相比，血肌酐、動脈血壓及24小時尿蛋白明顯升高，而體重無明顯改變（獨立樣本t檢驗，體重，t=1.559，P=0.14;血肌酐，t=-4.021，P=0.01;動脈血壓，t=-2.597，P=0.02;24小時尿

14、蛋白，t=-6.686，P=0.01）。⑵高鹽刺激14天后，與sham大鼠相比，CRF大鼠的心重、心重體重比、動脈血壓、24小時尿蛋白明顯升高，高鹽加劇了這一改變，并且能夠增加CRF大鼠血鈉和24小時尿鈉排泄（One-Way ANOVA，心臟重量，F(xiàn)=25.96，P=0.001;心臟/體重比值，F(xiàn)=49.960，P=0.000;SBP，F(xiàn)=13.635，P=0.001;血鈉，F(xiàn)=7.683，P=0.004;24h尿鈉，F(xiàn)=8.901，P

15、=0.000;24h蛋白，F(xiàn)=64.782，P=0.000）。⑶共鑒定了1877種蛋白，對其中的1830種進行了定量。正常鹽組中腎衰大鼠與假手術相比226種蛋白發(fā)生了差異性改變，其中107種升高，119種降低;慢性腎衰大鼠中高鹽組大鼠與正常鹽組相比220種發(fā)生了差異性改變，其中120種升高，100種降低。⑷本實驗通過iTRAQ技術共鑒定了1884種磷酸化肽段，其中1724種進行了定量。正常鹽組中腎衰大鼠與假手術大鼠相比165種磷酸化肽段

16、發(fā)生了差異性改變，其中89種升高，76種降低;慢性腎衰大鼠中高鹽組與正常鹽組相比172種磷酸化肽段發(fā)生了差異性改變，其中83種升高，89種降低。⑸采用DAVID6.7軟件對檢測到的763種磷酸化蛋白進行GO分類檢索。這些磷酸化蛋白主要具有結合、催化活性、酶調節(jié)活性轉運活性、結構分子活性、信號轉導活性等功能，涉及代謝、生物過程的調節(jié)、轉運、對刺激的反應、細胞生物合成、細胞通訊、細胞生長和分化等生物進程。⑹采用Proteome Discov

17、erer1.3(Thermo Scientific)軟件對鑒定到的1724種磷酸化肽段進行磷酸化位點分析，1002種肽段只有1個磷酸化位點被磷酸化，2個磷酸化位點被磷酸化的共有628種，3個磷酸化位點被磷酸化的共有83種，4個被磷酸化的共有11種，其中以1個被磷酸化的占的比例最大，為58.1％，其余各占36.4％、4.8％、0.6％。再對1個磷酸化位點被磷酸化的磷酸化肽段(1002種)進行磷酸化位點類型(S/T/Y)分析，以Phosph

18、o RS site probabilities大于75％為入選標準，結果顯示以pSer最為常見，為56.4％，pThr其次，占5.2％，pThy最少，占1.4％。⑺采用String軟件對本次實驗NC/NS組和HC/NC組檢測到的140和138種差異磷酸化蛋白進行蛋白相互作用分析，發(fā)現(xiàn)NC/NS組中15種磷酸化蛋白(Des、Vcl、Gja1、Tnni3、Mybpc3、Myh6、Lmna、Myoz3、Tns1、Pxn、Ctnna1、Pkp2

19、、Dsp、Map1b、Dynclli1)能夠形成網(wǎng)絡，連接最多的2個蛋白分別是des和vcl，是慢性腎衰大鼠中心臟的磷酸化蛋白信號通路網(wǎng)絡的中心節(jié)點。HC/NC組中23種磷酸化蛋白(Des、Vcl、Gja1、Tnni3、Mybpc3、Myh6、Myh7、Myh11、Myh9、Ryr2、Jph2、Lmna、Vim、Myoz3、Srrm1、Smm2、Hnrpd、Map1a、Map1b、Khdrbs2、Hsd17b8、Eif4b、Eif3s9

20、)能夠形成網(wǎng)絡，連接最多的3個蛋白分別是Des、Myh7和Tnni3，是給予高鹽飲食后慢性腎衰大鼠的心臟的磷酸化蛋白信號通路網(wǎng)絡的中心節(jié)點。⑻通過David在線分析軟件，我們對NC/NS組與HC/NC組檢測到的140和138種磷酸化蛋白所涉及到的KEGG信號通路進行了分析。發(fā)現(xiàn)NC/NS組中34種磷酸化蛋白(Atp2b1、Lmo7、Atp1a3、Slk、Ablim1、Adcy6、Camkk2、Ctnna1、Des、Dsg2、Dsp、Ep

21、b4111、Flnc、Pkp2、Pln、Pgk1、Pxn、Myh9、Myh9、Mybpc3、Mapk14、Lmna、Rply2、Gys1、Gja1、Vcl、Tnni3、Smap2、Rp12212、Ndufv3-ps1、Srf、Pdha1、Ppp1r3d、Tjp1）涉及到鈣信號轉導通路、擴張型心肌病、肥厚型心肌病、致心律失常性右心室心肌病、心臟肌肉收縮、肌動蛋白細胞骨架調節(jié)、醛固酮相關的鈉的重吸收、胰島素信號通路、MAPK、糖酵解/糖異生

22、、VEGF和縫隙連接等信號通路，其功能涉及代謝、生物過程的調節(jié)等過程。HC/NC組中34個蛋白質（Cr11、Blvrb、Ablim1、Ablim3、Rab4a、Pgls、Agpat2、Olr1475、Myh9、Myh7、Myh6、Mybpc3、Mapk14、Lmna、Herc1、Hspb1、Tjp1、Slc2a4、Hsp90ab1、Eif4b、LOC100362857、Pdha1、Pcca、Pcyt1a、LOC312502、Atp2b1

23、、Lmo7、Des、Dsp、Pln、Gys1、Gja1、Vcl、Tnni3)涉及到鈣信號轉導通路、擴張型心肌病、肥厚型心肌病、致心律失常性右心室心肌病、心臟肌肉收縮、肌動蛋白細胞骨架調節(jié)、醛固酮相關的鈉的重吸收、胰島素信號通路、MAPK、糖酵解/糖異生、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、RIG-Ⅰ樣受體信號通路、mTOR信號通路和縫隙連接等信號通路，其功能涉及代謝、生物過程的調節(jié)等過程。
　　 結論：①運用iTRAQ

24、技術成功研究了慢性腎衰大鼠的心臟磷酸化蛋白質組學，構建了慢性腎衰大鼠的心臟磷酸化蛋白質譜，發(fā)現(xiàn)了與慢性腎衰并發(fā)的心臟損害相關的140種差異磷酸化蛋白，構建了15個磷酸化蛋白參與的信號網(wǎng)絡，同時采用KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)34個蛋白參與了肥厚型心肌病、鈣信號傳導等通路。②高鹽使慢性腎衰大鼠的心臟中138種磷酸化蛋白的磷酸化水平發(fā)生了改變，其中23個差異磷酸化蛋白能夠形成網(wǎng)絡，34種蛋白涉及到鈣信號轉導通路和肥厚型心肌病等信號通路，其功能涉