1、目的：
　　本研究以sub-MIC ERY為干預(yù)因素，以臨床分離不同ERY耐藥表型的S.epidermidis菌株為研究對(duì)象，首先進(jìn)行生物膜形成能力的檢測(cè)和亞抑菌濃度ERY對(duì)其生物膜形成的影響，并進(jìn)一步分析其與細(xì)菌ERY耐藥特征的關(guān)系，同時(shí)考察菌株P(guān)IA合成、icaA基因的轉(zhuǎn)錄以及其上游調(diào)控因子sarA、ica及LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)的變化情況，以明確ERY耐藥特征及PIA上游調(diào)控因子與sub-MIC ERY影響S.epi

2、dermidis菌株生物膜形成的可能關(guān)系。
　　方法：
　　第一部分 亞抑菌濃度紅霉素對(duì)臨床分離表皮葡萄球菌生物膜形成的影響及其與細(xì)菌紅霉素耐藥表型的關(guān)系研究
　　1.1、對(duì)臨床分離菌株最小抑菌濃度（MIC值）的測(cè)定
　　采用“標(biāo)準(zhǔn)瓊脂平板倍比稀釋法”，以標(biāo)準(zhǔn)菌株S.aureus ATCC29213TM作為質(zhì)控菌株，結(jié)果判讀參照“2010版實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Stan

3、dards Institute，CLSI)”的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，測(cè)定96株臨床分離S.epidermidis菌株的MIC值。
　　1.2、細(xì)菌生物膜形成的觀察方法
　　采用結(jié)晶紫染色法觀察1/4 MIC ERY對(duì)S.epidermidis菌株生物膜形成的影響并統(tǒng)計(jì)分析1/4 MIC ERY作用下S.epidermidis菌株生物膜形成能力的改變與ERY耐藥表型的相關(guān)性。
　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，課題設(shè)定臨床分離S

4、.epidermidis菌株的生物膜OD值≥2倍標(biāo)準(zhǔn)菌株S.epidermidis ATCC12228TM的生物膜OD值，則認(rèn)為該菌株具有生物膜形成能力。1/4 MIC ERY對(duì)臨床分離S.epidermidis菌株生物膜形成的影響分為誘導(dǎo)、抑制或者不受影響三種類型，其區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)如下：t檢驗(yàn)比較各菌株ERY組與TSB對(duì)照組的生物膜OD值是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如果p＜0.05且ERY組的OD值大于TSB組的OD值，則認(rèn)為該菌株生物膜形成發(fā)生了

5、誘導(dǎo)現(xiàn)象;如果p＜0.05且ERY組的OD值小于TSB組的OD值，則認(rèn)為該菌株生物膜形成發(fā)生了抑制現(xiàn)象;如果p＞0.05，則認(rèn)為該菌株生物膜形成未發(fā)生變化。
　　第二部分 臨床分離表皮葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因分布及1/4最小抑菌濃度紅霉素作用下erm基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)研究
　　2.1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)鑒定臨床分離菌株大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因
　　采用PCR法檢測(cè)96株臨床分離S.epidermidis菌株中ermA，

6、ermB及ermC基因的分布情況，并對(duì)其中分布最廣的ermC基因進(jìn)行序列測(cè)定和同源性分析。
　　2.2、1/4最小抑菌濃度紅霉素作用下實(shí)驗(yàn)菌株ermC基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的時(shí)間-效應(yīng)考察
　　采用real time RT-PCR方法，考察與1/4 MIC ERY共同孵育0.5 h、2h、6h、12h和24 h，實(shí)驗(yàn)菌株SH04和SH10的ermC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平受其影響的情況，分析ermC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平變化與1/4 MIC

7、 ERY對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株生物膜形成影響的可能關(guān)系。
　　2.3、ermC基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平與生物膜形成能力的相關(guān)性分析
　　根據(jù)ermC基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的時(shí)間-效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，隨機(jī)抽取生物膜形成受1/4 MICERY抑制、誘導(dǎo)和不受其影響三種表型的菌株各8-9株，采用real time RT-PCR方法，考察與1/4 MIC ERY共同孵育2h，各菌株ermC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，分析該因素與1/4 MIC ERY作用下S.epidermi

8、dis菌株生物膜OD值與無(wú)ERY作用下S.epidermidis菌株生物膜OD值的比率之間的可能關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　第一部分 亞抑菌濃度紅霉素對(duì)臨床分離表皮葡萄球菌菌株生物膜形成的影響及其與細(xì)菌紅霉素耐藥表型的關(guān)系研究
　　1、臨床分離表皮葡萄球菌菌株的紅霉素耐藥情況
　　96株臨床分離S.epidermidis中，85株為ERY耐藥(MIC≥8 mg/L)菌株，耐藥率為88.5％。其中15株MIC值在8～1

9、28 mg/L范圍內(nèi)，70株MIC值≥128 mg/L。
　　2、1/4最小抑菌濃度紅霉素對(duì)臨床分離表皮葡萄球菌生物膜形成的影響
　　結(jié)果顯示，96株臨床分離S.epidermidis菌株均可形成生物膜。生物膜形成受1/4 MICERY影響的菌株共27株，且都是ERY耐藥菌株。其中4株生物膜形成發(fā)生了抑制現(xiàn)象(p＜0.05)，23株生物膜形成發(fā)生了誘導(dǎo)現(xiàn)象(p＜0.05)。生物膜誘導(dǎo)菌株中，18株的生物膜誘導(dǎo)程度在1.11-

10、2.0倍之間，5株的生物膜誘導(dǎo)程度大于2倍。其余58株ERY耐藥株及11株ERY敏感株的生物膜形成均未受1/4 MIC ERY的明顯影響。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，1/4 MIC ERY對(duì)臨床分離S.epidermidis ERY耐藥株和敏感株生物膜形成的影響不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.861，p=0.031)，提示1/4 MIC ERY作用下，臨床分離S.epidermidis菌株生物膜形成與菌株的ERY耐藥表型相關(guān)。
　　3、體外

11、誘導(dǎo)耐藥結(jié)果及1/4最小抑菌濃度紅霉素對(duì)誘導(dǎo)耐藥前后菌株生物膜形成的影響
　　11株臨床分離ERY敏感S.epidermidis菌株均被成功誘導(dǎo)成ERY耐藥菌株，誘導(dǎo)耐藥后的MIC值分布在16～256μg/ml范圍。平行考察1/4 MIC ERY作用下，11株ERY敏感S.epidermidis菌株及其誘導(dǎo)耐藥后菌株生物膜的形成情況，結(jié)果顯示:誘導(dǎo)耐藥后S.epidermidis菌株SH22、SH51和SH67的ERY組生物膜OD

12、值與其對(duì)照組比較，明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);誘導(dǎo)耐藥后S.epidermidis菌株SH40、SH46、SH52和SH77的ERY組生物膜OD值與其對(duì)照組比較，明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。原11株ERY敏感S.epidermidis菌株ERY組生物膜OD值與其對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　第二部分 臨床分離表皮葡萄球菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因分布及1/4最小抑菌濃度紅霉素作用下er

13、m基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)研究
　　1、96株臨床分離表皮葡萄球菌ermA、ermB及ermC基因的分布情況
　　96株S.epidermidis菌株ermC基因的陽(yáng)性擴(kuò)增率為94.8％(91/96); ermA及ermB基因的陽(yáng)性擴(kuò)增率均為6.2％(6/96)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果提示，各基因的分布情況在生物膜形成不同影響類型臨床分離S.epidermidis菌株之間無(wú)差異(p＞0.05)。其中ermC基因在生物膜形成發(fā)生抑制、誘導(dǎo)和不受

14、影響的S.epidermidis菌株中分布率分別為:100％、95.7％和94.2％。將各菌株擴(kuò)增出的ermC基因產(chǎn)物進(jìn)行堿基序列測(cè)定，并將測(cè)得的堿基序列在Pubmed NCBI基因庫(kù)中進(jìn)行同源序列比對(duì)，結(jié)果各菌株測(cè)得的堿基序列與NCBI基因庫(kù)中的同源序列比較，同源性達(dá)99％，未發(fā)現(xiàn)有意義的突變位點(diǎn)。
　　2、實(shí)驗(yàn)菌株ermC基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的時(shí)間-效應(yīng)結(jié)果
　　對(duì)臨床分離S.epidermidis菌株SH04和SH10 e

15、rmC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平進(jìn)行時(shí)間-效應(yīng)考察發(fā)現(xiàn):在0.5 h、2h和12 h時(shí)間點(diǎn)，生物膜抑制菌株SH04的ermC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生明顯抑制(p＜0.05);在6h時(shí)間點(diǎn)，該菌株ermC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生明顯誘導(dǎo)(p＜0.05);在24 h時(shí)間點(diǎn)，該菌株ermC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生抑制，但與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。在0.5 h、2h和6h時(shí)間點(diǎn)，生物膜誘導(dǎo)菌株SH10的ermC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生顯著誘導(dǎo)(p＜0.0

16、5);在12h和24 h時(shí)間點(diǎn)，該菌株ermC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均發(fā)生抑制，但孵育12h，ERY組ermC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);而孵育24 h，ERY組ermC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著低于對(duì)照組(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、1/4 MIC ERY對(duì)臨床分離ERY耐藥S.epidermidis菌株生物膜形成可產(chǎn)生誘導(dǎo)和抑制兩種相反的作用。
　　2、ERY耐藥表型與1/4 MIC E