1、細(xì)菌生物膜(bacterial biofilm)是細(xì)菌利用自身分泌的含水聚合物質(zhì)黏附成團(tuán),附著于固體物質(zhì)表面的具有特殊微結(jié)構(gòu)的細(xì)菌群落。生物膜可形成于多種材料表面,也包括機(jī)體組織和植入的醫(yī)療器械,生物膜細(xì)菌具備較高的耐藥能力且具有可播散的特點(diǎn),其引起的感染在臨床上常表現(xiàn)為遷延不愈。表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,S epidermidis)為最常見的凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase negati

2、ve staphylococcus,CNS),常于植入的醫(yī)療器械表面形成生物膜,而S epidermidis引起的生物膜感染是目前醫(yī)療器械相關(guān)感染的主要原因,對(duì)其生物膜感染的防治是現(xiàn)今抗感染研究領(lǐng)域的難點(diǎn)和重點(diǎn)之一。
　　 近年來的一些研究提示,抗菌藥物雖然難以清除生物膜菌,但在亞抑菌濃度(subinhibitory concentration,亞-MIC)下,卻可能有效干擾生物膜的形成,這為有效預(yù)防臨床細(xì)菌生物膜形成和播散提供

3、了希望。鑒于其具有良好的臨床應(yīng)用前景,亞-MIC抗生素對(duì)細(xì)菌生物膜形成的調(diào)控作用開始受到重視。大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物(Macrolides)在體外亞-MIC濃度下顯示了對(duì)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鳥分枝桿菌Mycobacterium avium)等生物膜形成的抑制作用,受到了較多關(guān)注。大環(huán)內(nèi)酯類藥物屬廣譜抗菌藥物,在臨床廣泛應(yīng)用于β-鏈球菌、肺炎鏈球菌、葡萄球菌和腸球菌等病原菌的感染治療,但其亞-MIC濃

4、度甚至常規(guī)治療濃度是否也對(duì)這些病原菌生物膜形成有一定的影響?對(duì)此現(xiàn)有的研究提示極少。目前也尚未有研究關(guān)于亞-MIC大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對(duì)臨床分離Staphylococcus epidermidis生物膜形成的影響。對(duì)此進(jìn)行研究將對(duì)進(jìn)一步了解亞-MIC大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的生物膜調(diào)控機(jī)制以及尋找有效防治臨床細(xì)菌生物膜感染的有效手段均具有一定的科學(xué)意義和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 在本研究中,利用微孔測(cè)定法考察了1/4 MIC紅霉素(erythr

5、omycin,EM)對(duì)105株紅霉素耐藥的臨床分離S epidermidis生物膜形成的影響,篩選出了21株生物膜受EM顯著誘導(dǎo)的菌株,繼而考察了三種大環(huán)內(nèi)酯類藥物阿奇霉素(azithromycin,AZM)、克拉霉素(clarithromycin,CAM)和紅霉素對(duì)這21株菌生物膜形成的作用。通過PCR法鑒定105株臨床分離S epidermidis的icaA基因型,探討了亞-MIC大環(huán)內(nèi)酯類藥物的作用和icaA基因型的關(guān)系,并從中選

6、取出分別為icaA陽性和icaA陰性的菌株Sepidermidis SW029和S epidermidis SW036作進(jìn)一步的時(shí)效和量效研究。在機(jī)理研究中以S epidermidis SW029為主要研究對(duì)象,首先考察了。EM(8mg/L,1/16 MIC)對(duì)其生長的影響,其后通過激光共聚焦顯微鏡以及掃描電子顯微鏡考察了EM對(duì)其初始黏附的影響,并觀察了亞-MIC EM作用下S epidermidis SW029細(xì)菌生物膜形成的過程。生

7、物膜相關(guān)基因icaA,sigB,atlE and sarA的考察以realtime RT-PCR方法進(jìn)行,在此基礎(chǔ)上選取時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步對(duì)S epidermidis SW029全基因組表達(dá)譜作對(duì)比分析,旨在尋找亞-Mic大環(huán)內(nèi)酯類藥物的作用靶點(diǎn)和可能的作用機(jī)制。在研究的最后部分,我們嘗試建立了一種新的細(xì)菌生物膜感染的體內(nèi)模型。
　　 研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.1/4 MIC EM顯示了對(duì)20％臨床分離S epiderm

8、idis生物膜形成的顯著誘導(dǎo)作用,令人關(guān)注的是另兩種大環(huán)內(nèi)酯類藥物AZM和CAM顯示了對(duì)這20％菌株相似的誘導(dǎo)作用,誘導(dǎo)的幅度與EM顯示了相關(guān)性(R2均為0.91)。提示大環(huán)內(nèi)酯類藥物可誘導(dǎo)部分臨床分離S epidermidis菌株的生物膜形成,同時(shí)研究顯示生物膜的這種誘導(dǎo)作用和icaA基因型之間沒有必然的聯(lián)系。
　　 2.icaA基因型鑒定結(jié)果顯示基因陽性的菌株生物膜形成能力顯著強(qiáng)于icaA陰性的菌株,但EM的生物膜誘導(dǎo)作用與

9、icaA基因型無關(guān);亞-MIC EM沒有顯示對(duì)金黃色葡萄球菌的誘導(dǎo)作用,提示其作用對(duì)S epidermidis具特異性。
　　 3.所有三個(gè)濃度(1/4,1/16,1/64 Mic)的AZM,CAM和EM顯示了對(duì)S epidermidisSW029生物膜形成的顯著誘導(dǎo)作用,并沒有顯示出劑量依賴性。藥物對(duì)S epidermidisSW036的生物膜誘導(dǎo)作用則有明顯的劑量依賴性;大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)這兩株菌的生物膜誘導(dǎo)作用可持續(xù)至48h

10、。
　　 4.EM8mg/L(1/16MIC)在24h內(nèi)可顯著抑制S epidermidis SW029的生長。EM并沒有顯示對(duì)其初始黏附的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示藥物的誘導(dǎo)作用可能與細(xì)菌初始黏附能力的改變無關(guān)。
　　 5.以激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)菌生物膜的形成過程,EM8mg/L組細(xì)菌在12h時(shí)多糖開始有顯著分泌,而同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組多糖分泌并不明顯,24h兩組多糖分泌均有明顯增加。至48h,通過掃描電鏡觀察到EM組的

11、生物膜開始呈現(xiàn)膜狀包裹的典型的生物膜性狀,于對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)。
　　 6.EM8mg/L作用6h,icaA,sigB,atlE和sarA基因與對(duì)照組相對(duì)基因表達(dá)比值分別為1.2,2.0,6.2和1.7倍,至24h相對(duì)基因表達(dá)比值分別為2.8,0.6,2.4和6.9倍。提示atlE的誘導(dǎo)作用可能是生物膜誘導(dǎo)的重要途徑,而icaA和sarA的誘導(dǎo)從時(shí)間點(diǎn)和作用強(qiáng)度分析可能為繼發(fā)性的誘導(dǎo)作用。
　　 7.全基因組表達(dá)譜分析顯示,

12、EM8mg/L使S epidermidis SW029基因表達(dá)發(fā)生了廣泛的變化,有332個(gè)基因發(fā)生了2倍下調(diào),同時(shí)395個(gè)基因表達(dá)發(fā)生了2倍上調(diào),共占所有表達(dá)基因的近三分之一,其中一些涉及細(xì)菌生長,黏附,細(xì)菌外膜的生物合成等生物膜形成相關(guān)調(diào)節(jié)基因,而atlE的誘導(dǎo)作用較為顯著,提示atlE基因調(diào)節(jié)可能是調(diào)節(jié)機(jī)制之一。由于核糖體蛋白的編碼基因表達(dá)幾乎一致受到誘導(dǎo),我們推測(cè)與大環(huán)內(nèi)酯類藥物的抗菌機(jī)理一致,亞-MIC大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物作用于核

13、糖體并抑制蛋白質(zhì)合成,但其在較低濃度下仍然能夠發(fā)揮顯著生物膜誘導(dǎo)作用的現(xiàn)象提示藥物與核糖體蛋白的相互作用可能存在結(jié)合位點(diǎn)或基因突變的差異。因此進(jìn)一步對(duì)核糖體蛋白及基因的研究可能有助于研究亞-MIC藥物發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的機(jī)制。
　　 8.通過:Babl/c小鼠建立了一種的新的生物膜感染模型。經(jīng)方法學(xué)研究,該模型具有微創(chuàng),操作性強(qiáng),評(píng)價(jià)直觀等優(yōu)點(diǎn),并且模型可在一定程度上客觀反應(yīng)考察菌株生物膜形成能力的差異,但模型建立后的生物膜感染程度的

14、評(píng)價(jià)方法在特異性上還存在缺陷,還需進(jìn)一步完善。
　　 本課題研究結(jié)果提示,大環(huán)內(nèi)酯類藥物在亞-MIC濃度下,對(duì)臨床分離S epidermidis的生物膜形成總體上存在誘導(dǎo)的趨勢(shì),其機(jī)理可能是亞-MIC大環(huán)內(nèi)酯類藥物通過抑制核糖體蛋白質(zhì)合成,繼而影響生物膜相關(guān)基因的表達(dá)誘導(dǎo)生物膜形成,其中atlE可能起到了重要的作用。近年來葡萄球菌的耐藥率逐年升高,同時(shí)大環(huán)內(nèi)酯類藥物在臨床又使用廣泛,而亞-MIC是一個(gè)相對(duì)量的概念,耐藥菌感染的患

15、者所接受治療的抗菌藥物濃度通常只能達(dá)到亞-MIC水平。因此本研究結(jié)果警示,對(duì)那些有/潛在S epidermidis生物膜感染的患者,接受大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療可能存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。
　　 人類利用抗菌藥物(作為殺菌劑或抑菌劑)殺滅或抑制細(xì)菌生長,但究其本源,抗菌藥物來源于由細(xì)菌合成并釋放的小分子活性物質(zhì),其可為細(xì)菌感知并參與調(diào)控一系列生命行為,其中也包括細(xì)菌生物膜的形成。鑒于目前對(duì)亞-MIC抗菌藥物對(duì)細(xì)菌生物膜的調(diào)控還知之甚少,尚有許