1、胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)作為一種腸肽激素，具有血糖依賴性促胰島素分泌等多種生理功能，在2型糖尿病的臨床治療中具有較好的應用前景。但由于體內(nèi)二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)的快速降解和腎臟代謝作用，導致其半衰期很短，使臨床應用受到了很大限制。因此，開發(fā)更穩(wěn)定的GLP-1類似物，延長其體內(nèi)有效作用時間就成為近年來關注的一個熱門課題。 本文首先構(gòu)建含有大鼠GLP-1受體(GLP-1

2、R)基因的重組表達載體pcDNA3.1(+)/GLP-1R，并轉(zhuǎn)染含有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的CHO/EGFP細胞，經(jīng)抗性篩選、單克隆化和功能性分析，得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細胞系CHO/EGFP/GLP-1R。與陰性對照細胞相比，該細胞系能功能性表達GLP-1R并且通過與cAMP偶聯(lián)的EGFP報告基因表達量來反映受體的激活情況。經(jīng)考察檢測EGFP表達的最佳時間為8 h，：EGFlP的表達量與GLP-1的濃度有良好的相關性

3、，其EC<,50>值為0.74 nmol/L。該功能性報告基因細胞分析系統(tǒng)不僅可以用于GLP-1R激動劑的高通量篩選，而且可以對GLP-1R激動劑的體外活性進行定量分析，為研究和開發(fā)長效GLP-1類似物奠定了方法學基礎。 利用上述細胞模型篩選噬菌體隨機12肽庫。經(jīng)過四輪篩選，與細胞表面GLP-1R結(jié)合的噬菌體得到了富集，回收率提高了1，500倍。隨機挑取1，000個噬菌體克隆，經(jīng)噬菌體ELISA鑒定和功能性篩選，45％的噬菌體

4、克隆能夠與細胞結(jié)合，28％的噬菌體克隆能夠被GLP-1競爭下來，僅有10個克隆(1％)能夠刺激CHO/EGFP/GLP-1R細胞產(chǎn)生.EGFP表達。10個陽性噬菌體克隆序列分析結(jié)果顯示為三組序列，分別對應于GLP-1三個不同區(qū)域的氨基酸殘基(Group 1：23-34；Group 2：18-29；Group 3：6-17)。根據(jù)定位于GLP-1 N端區(qū)域的第3組序列合成了 GLP-1 模擬肽 KS-12 (KHADGSFITEAS)和它

5、的類似肽HS-11(HADGS FITEAS)，以及GLP-1的N端多一個Lys的類似物KGLP-1。體外活性分析結(jié)果顯示，KS-12和HS-11均能以劑量依賴的方式激活GLP-1R，但其EC<,50>值比天然GLP-1和KGLP-1高約1，000倍。而體外穩(wěn)定性分析結(jié)果表明，與GLP-1和HS-11相比，KS-12和KGLP-1具有顯著的抗DPP-Ⅳ降解作用，與DPP-Ⅳ粗提物作用12 h后仍能保持83％和80％的活性。進一步體內(nèi)活性

6、分析結(jié)果表明，KS-12能以劑量依賴的方式顯著降低小鼠體內(nèi)的血糖水平，并且在相同的劑量下，給藥1 h后仍具有明顯的降血糖作用。然而，天然GLP-1在給藥1 h后則未能顯示明顯的降血糖作用。 其次，本文利用金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)作為融合標簽，構(gòu)建了5種GLP-1與SPA以不同形式連接的融合蛋白，并在大腸桿菌BL21中得到了正確表達。米用CHO/EGFP/GLP-1R細胞對純化后的融合蛋白進行的體外活性評價結(jié)果表明，5種融

7、合蛋白均具有GLP-1R激動劑活性，但活性均低于天然的GLP-1。將SPA融合在GLP-1的C端與融合在N端相比，能提高融合蛋白的活性。在二者之間加入不同長度(GGGGS)重復序列，有助于融合蛋白活性的提高，但間隔序列的長度對活性的影響沒有顯著差別。以上實驗結(jié)果，為進一步研究和構(gòu)建長效GLP-1融合蛋白提供了理論依據(jù)。根據(jù)上述結(jié)果，本研究進一步構(gòu)建了GLP-1及其類似物KGLP-1與人血清白蛋白(HSA)的分泌型融合表達載體pPIC9K

8、/GLP-1/HSA和pPIC9K/KGLP-1/HSA。將其轉(zhuǎn)化P. pastoris GS115后，經(jīng)His營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和G418抗性篩選，分別得到兩組高抗性重組子分別命名為重組菌株P.pastoris GS115/GLP-1/HSA和GS115/KGLP-1/HSA。對兩組重組菌株進行小規(guī)模誘導表達，結(jié)果顯示融合蛋白GLP-1/HSA和KGLP-1/HSA在P.pastoris中最高表達量分別為58.5和75.6 mg/L。利

9、用偶聯(lián)有抗HSA抗體的免疫磁性纖維素微球?qū)Πl(fā)酵液中的GLP-1/HSA和KGLP-1/HSA進行分離純化。經(jīng)一步免疫磁性分離，GLP-1/HSA和KGLP-1/HSA的回收率分別為90.6％和95.6％，純度分別提高了72.8和55.2倍。SDS-PAGE分析表明，純化后的融合蛋白呈現(xiàn)單一條帶，其純度分別為96.1％和95.6％。進一步的體外活性分析結(jié)果表明，GLP-1/HSA和KGLP-1/HSA均具有與GLP-1相似的GLP-1R激

10、動劑活性，EC<,50>值分別為96和3 14 nmol/L，但其活性明顯低于天然的GLP-1。 利用以上構(gòu)建的P pastoris GS115/GLP-1/HSA和GS115/KGLP-1/HSA重組菌株，在10L發(fā)酵罐水平進行發(fā)酵表達，其表達量分別為63.6和84.2 mg/L。含有GLP-1/HSA和KGLP-1/HSA的發(fā)酵上清液經(jīng)中空纖維柱濃縮、疏水層析、陰離子交換和凝膠過濾一系列純化過程，其純度分別提高了69.1和

11、55.6倍，總收率分別為16.0％和20.5％。SDS-PAGE分析表明純化后的融合蛋白呈現(xiàn)單一條帶，HPLC分析結(jié)果顯示其純度分別達到95.8％和93.9％。通過MALDI-TOF-MS確定融合蛋白分子量分別為70，169.2 Da和70，297.8 Da，與預計的分子量一致。體內(nèi)活性分析結(jié)果表明，GLP-1/HSA和KGLP-1/HSA能以劑量依賴的方式顯著降低小鼠體內(nèi)的血糖水平。雖然GLP-1/HSA和KGLP-1/HSA在給藥后

12、1 h才表現(xiàn)出明顯的降血糖作用，但該作用可以分別維持4 h和8 h，而天然GLP-1的降血糖作用在給藥后1 h即消失。以上結(jié)果表明，將GLP-1及其類似物與HSA進行融合表達，能明顯地減緩其體內(nèi)代謝清除率，延長其體內(nèi)有效作用時間。 本論文以GLP-1R為靶點構(gòu)建了含有EGFP報告基因的功能性細胞分析系統(tǒng)，以此作為GLP-1R激動劑體外活性分析和高通量篩選的模型。利用該模型在噬菌體展示隨機肽庫中進行功能性篩選，得到了具有抗DPP