1、目的：明確人氣道粘膜上皮組織中是否有瞬時(shí)受體電位蛋白-8(TRPM8)的表達(dá)及其分布特點(diǎn)，并進(jìn)一步探討其在慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者與正常人氣道粘膜上皮組織中的表達(dá)差異；探明人氣道上皮細(xì)胞TRPM8受體的基本特性；明確冷刺激是否誘導(dǎo)黏液高分泌及TRPM8受體在此過(guò)程中所起的作用；初步探明冷刺激誘導(dǎo)黏液高分泌過(guò)程的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)籍TRPM8為切入點(diǎn)研究冷刺激作用于氣道所產(chǎn)生的對(duì)黏液分泌的調(diào)控作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以期探明冷刺

2、激在慢性氣道炎癥性疾病中的作用，為預(yù)防及控制冷空氣刺激誘發(fā)此類疾病的反復(fù)發(fā)作提供新的思路。
　　方法：(1)收集行肺葉切除術(shù)患者的上葉段支氣管開(kāi)口處粘膜組織，采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)TRPM8蛋白的表達(dá)及其分布特點(diǎn)，用Imagepro-plus6.0軟件進(jìn)行圖像分析以比較COPD患者與正常人氣道粘膜上皮組織中的表達(dá)差異，并進(jìn)一步采用Western bolt法及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)法分別檢測(cè)COPD患者

3、與正常人氣道粘膜上皮組織中TRPM8蛋白及TRPM8 mRNA的表達(dá)差異。(2)體外培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，MTT法檢測(cè)不同濃度左旋薄荷醇(menthol)、TRPM8通道特異性拈抗劑BCTC及冷刺激對(duì)細(xì)胞活力的影響。用Fluo3-AM進(jìn)行熒光探針裝載，激光共聚焦測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。16HBE細(xì)胞經(jīng)不同濃度menthol處理后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，以選取最佳作用濃度。為探明TRPM8陽(yáng)離子通道的基本特點(diǎn)，用TRPM8shRNA、scram

4、ble TRPM8 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞，并采用Western bolt法檢測(cè)TRPM8 shRNA轉(zhuǎn)染組、scrmnble TRPM8 shRNA轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染前對(duì)照組的TRPM8蛋白表達(dá)水平，以明確TRPM8 shRNA對(duì)TRPM8基因的沉默效率。分別設(shè)立1mM menthol組、1mM menthol+BCTC組、1mM menthol+TRPM8 shRNA組、1mM menthol+scramble TRPM8 sh

5、RNA組；18℃組、18℃+BCTC組、18℃+TRPM8shRNA組、18℃+scramble TRPM8 shRNA組，采用鈣調(diào)子成像技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)態(tài)變化。(3)將培養(yǎng)的16HBE細(xì)胞分為：1mMmenthol組、1mM menthol+BCTC15μm組、1mM menthol+TRPM8shRNA組、1mM menthol+scramble TRPM8 shRNA組，18℃組、18℃+BCTC15μm組、18℃+TRPM

6、8 shRNA組、18℃+scrambleTRPM8 shRNA組，收集各個(gè)時(shí)點(diǎn)的培養(yǎng)上清液及細(xì)胞，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法測(cè)定各組培養(yǎng)上清液及細(xì)胞內(nèi)MUC5AC蛋白含量，用real-time PCR測(cè)定各組細(xì)胞MUC5AC mRNA含量。進(jìn)一步將細(xì)胞分為①1mM menthol組、1mM menthol+BCTC15μm組、1mMmenthol+TRPM8 shRNA組(各組均處理26h)；②18℃組、18℃+BCTC15μm

7、組、18℃+TRPM8 shRNA組(各組均處理6h)，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色，激光共聚焦顯微鏡觀察氣道各組細(xì)胞MUC5AC的免疫熒光表達(dá)情況。(4)pEGFP-N1 vector、PLCδ1-PH-GFP轉(zhuǎn)染6HBE細(xì)胞，并分組處理：對(duì)照組(pEGFP-N1 vector轉(zhuǎn)染+1mM menthol組、pEGFP-N1 vector轉(zhuǎn)染+18℃)、實(shí)驗(yàn)組(PLCδ1-PH-GFP轉(zhuǎn)染+1mM menthol組、PLCδ1-PH-GFP轉(zhuǎn)

8、染+1mM menthol+BCTC15μM組、PLCδ1-PH-GFP轉(zhuǎn)染+1mM menthol+TRPM8 shRNA組、PLCδ1-PH-GFP轉(zhuǎn)染+18℃組、PLCδ1-PH-GFP轉(zhuǎn)染+18℃+BCTC15μM組、PLCδ1-PH-GFP轉(zhuǎn)染+18℃+TRPM8 shRNA組。激光共聚焦掃描顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察各組GFP綠色熒光在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿區(qū)域的分布，計(jì)算各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞平均膜(Fm)/漿熒光強(qiáng)度(Fc)比率。(5)用人胎盤組織c

9、DNA為模板，利用PCR技術(shù)構(gòu)建MARCKS目的基因載體，再利用重疊PCR技術(shù)將PSD位點(diǎn)的4個(gè)絲氨酸用天冬氨酸替換，并構(gòu)建突變型基因載體。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定后將空載體、MARCKS-PSD-mutant質(zhì)粒、野生型MARCKS質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞，分別用1mM menthol刺激28h及冷刺激8h處理細(xì)胞，測(cè)定每組細(xì)胞分泌MUC5AC蛋白水平。
　　結(jié)果：(1)免疫組化顯示TRPM8陽(yáng)性染色細(xì)胞位于支氣管粘膜上皮內(nèi)，

10、TRPM8蛋白主要分布于支氣管粘膜上皮基底細(xì)胞或小顆粒細(xì)胞的細(xì)胞膜，部份分布于柱狀上皮細(xì)胞或杯狀細(xì)胞的胞漿(尤其是靠近管腔一側(cè))及細(xì)胞膜。用Imagepro-plus6.0軟件進(jìn)行圖像分析，以黃色區(qū)域作為AOI(area of interest)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：COPD組的支氣管粘膜上皮IOD/area值(0.24±0.049)顯著高于正常對(duì)照組(0.19±0.036)，P=0.037，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。real-time PCR結(jié)果顯示：

11、COPD組支氣管粘膜內(nèi)TRPM8 mRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的3.13±0.39倍，顯著高于正常對(duì)照組(P=0.012)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western-blot結(jié)果顯示：COPD組支氣管粘膜內(nèi)TRPM8蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組(P=0.030)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)細(xì)胞經(jīng)不同濃度menthol、BCTC及18℃處理后，細(xì)胞的增殖活力在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化，而30μm及60μm BCTC對(duì)細(xì)胞的活力有抑制作用。1

12、mM menthol處理組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著高于低濃度menthol處理組，而更高濃度menthol的作用并不優(yōu)于1mM menthol，所以在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇1mM menthol作為刺激濃度。穩(wěn)轉(zhuǎn)染TRPM8 shRNA、scramble TRPM8shRNA的16HBE細(xì)胞生長(zhǎng)速度及形態(tài)與正常細(xì)胞無(wú)差異。TRPM8shRNA轉(zhuǎn)染組TRPM8蛋白表達(dá)量顯著低于轉(zhuǎn)染前對(duì)照組及scrambleTRPM8 shRNA轉(zhuǎn)染組，而scram

13、ble TRPM8 shRNA轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較TRPM8蛋白表達(dá)則無(wú)明顯差異。1mM menthol在處理細(xì)胞0.5min-8min的各個(gè)時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度均顯著高于vehicle control組，其中從0.5min到4min時(shí)間段細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度呈明顯上升趨勢(shì)，4min后出現(xiàn)平臺(tái)期。5，10，15μm BCTC對(duì)1mM menthol所誘導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流起到抑制作用，轉(zhuǎn)染了TRPM8 shRNA的細(xì)胞其鈣離子內(nèi)流同樣受到抑制

14、。1mM menthol處理細(xì)胞4min時(shí)，15μm BCTC的抑制作用明顯強(qiáng)于5，10μm BCTC(P<0.05)，TRPM8 shRNA的轉(zhuǎn)染可顯著阻斷1mM menthol所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高(P<0.05)，而scramble TRPM8 shRNA則對(duì)1mM menthol所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。18℃在處理細(xì)胞0.5min-8 min的各個(gè)時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度均顯著高于未處理對(duì)照組

15、，其中從0.5min到6min時(shí)間段細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度呈明顯漸進(jìn)上升趨勢(shì)，6min后出現(xiàn)平臺(tái)期。5，10，15μm BCTC對(duì)冷刺激所誘導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流起到抑制作用，轉(zhuǎn)染了TRPM8 shRNA的細(xì)胞其鈣離子內(nèi)流同樣受到抑制。冷刺激處理細(xì)胞6min時(shí)，15μm BCTC的抑制作用明顯強(qiáng)于5，10μmBCTC(P<0.05)。TRPM8 shRNA的轉(zhuǎn)染可顯著阻斷冷刺激所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高(P<0.05)，而scramble TRP

16、M8 shRNA則對(duì)冷刺激所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。鑒于15μmBCTC對(duì)1mM menthol及冷刺激所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高的抑制作用顯著強(qiáng)于5，10μm BCTC，所以在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇15μm作為最終的實(shí)驗(yàn)濃度。(3)細(xì)胞受1mM menthol或冷刺激處理后其MUC5AC mRNA表達(dá)分別于5h及1h后開(kāi)始明顯升高，峰值分別出現(xiàn)在24h及4h，分別較vehicle對(duì)照組及未處理對(duì)照組升高3.08

17、及2.57倍(P=0.00)，繼峰值后MUC5AC mRNA的表達(dá)有下降趨勢(shì)。BCTC及TRPM8 shRNA在峰值出現(xiàn)時(shí)點(diǎn)可顯著抑制MUC5AC mRNA表達(dá)，而scramble TRPM8 shRNA對(duì)MUC5AC mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。由細(xì)胞分泌出胞外的MUC5AC蛋白在1mM menthol刺激后于5min時(shí)迅速升高，緊接著進(jìn)行平臺(tái)期(5 min-360 mm)，繼平臺(tái)期后MUC5AC蛋白的分泌呈漸近持續(xù)升高，直到28h后再度

18、進(jìn)入平臺(tái)期。MUC5AC蛋白的分泌于28h時(shí)為vehicle對(duì)照組的3.19倍(P=0.00)。冷刺激組于10min時(shí)胞外的MUC5AC蛋白表達(dá)迅速升高，平臺(tái)期為10min-120min，繼平臺(tái)期后MUC5AC蛋白的分泌呈漸近持續(xù)升高，直到8h后再度進(jìn)入平臺(tái)期。MUC5AC蛋白的分泌值于8h時(shí)為未刺激對(duì)照組的2.18倍(P=0.00)。BCTC及TRPM8 shRNA于28h時(shí)點(diǎn)可顯著抑制1mM menthol誘導(dǎo)的MUC5AC蛋白的分

19、泌(P值均為0.00)，而scramble TRPM8 shRNA對(duì)1mM menthol誘導(dǎo)的MUC5AC蛋白分泌無(wú)明顯影響(P=0.154)；BCTC及TRPM8 shRNA在8h時(shí)點(diǎn)可顯著抑制冷刺激誘導(dǎo)的MUC5AC蛋白分泌(P值均為0.00)，而scrambleTRPM8 shRNA對(duì)冷刺激誘導(dǎo)的MUC5AC蛋白分泌無(wú)明顯影響(P=0.373)。胞內(nèi)合成的MUC5AC蛋白在1mM menthol刺激組于8h后明顯升高，并于26h

20、達(dá)到峰值，為vehicle對(duì)照組的1.50倍(P=0.00)，繼峰值后出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。胞內(nèi)合成的MUC5AC蛋白在冷刺激組于4h后明顯升高，并于6h達(dá)到峰值，為未刺激對(duì)照組的1.45倍(P=0.00)，繼峰值后出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。BCTC及TRPM8 shRNA在峰值出現(xiàn)時(shí)點(diǎn)可顯著抑制1mM menthol及冷刺激誘導(dǎo)的胞內(nèi)MUC5AC蛋白表達(dá)，而scrmnble TRPM8 shRNA對(duì)胞內(nèi)MUC5AC蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。免疫細(xì)胞

21、化學(xué)結(jié)果顯示：1mM menthol或冷刺激分別作用于細(xì)胞26h、6h后，細(xì)胞胞漿中MUC5AC表達(dá)較對(duì)照組有明顯增加，BCTC及TRPM8 shRNA對(duì)1mM menthol或冷刺激誘導(dǎo)的胞內(nèi)MUC5AC蛋白表達(dá)起顯著抑制作用，scramble TRPM8 shRNA對(duì)1mMmenthol或冷刺激誘導(dǎo)的胞內(nèi)MUC5AC蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。(4)16HBE細(xì)胞表達(dá)PLCδ1-PH-GFP作為PLCδ1-PH-GFP組，表達(dá)pEGFP-N

22、1 vector的細(xì)胞作為對(duì)照組。結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞給予menthol或冷刺激處理前后，GFP的綠色熒光未見(jiàn)轉(zhuǎn)位變化，均持續(xù)呈胞漿與胞膜非特異性分布。在PLCδ1-PH-GFP組，menthol或冷刺激處理前，可見(jiàn)綠色熒光在胞膜上濃集，而在胞漿呈低亮度及不均勻分布；給予menthol或冷刺激處理后，胞膜的綠色熒光漸降低同時(shí)胞漿熒光漸變亮，其動(dòng)力學(xué)特征為：在給予menthol處理60 s后即出現(xiàn)明顯的綠色熒光轉(zhuǎn)位，在60-200 s期間

23、呈持續(xù)綠色熒光轉(zhuǎn)位，并于給藥200 s后出現(xiàn)轉(zhuǎn)位的停滯狀態(tài)；在給予冷刺激處理60 s后即出現(xiàn)明顯的綠色熒光轉(zhuǎn)位，在60-220 s期間呈持續(xù)綠色熒光轉(zhuǎn)位，繼之進(jìn)入轉(zhuǎn)位的停滯狀態(tài)。BCTC及TRPM8 shRNA對(duì)menthol及冷刺激誘導(dǎo)的綠色熒光轉(zhuǎn)位有顯著抑制作用。(5)本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了PSD-mutant MARCKS突變體。轉(zhuǎn)染PSD-mutant MARCKS cDNA可顯著抑制由menthol及冷刺激誘導(dǎo)的MUC5AC蛋白分泌

24、(P值均為0.002)，而轉(zhuǎn)染野生型MARCKS組的MUC5AC蛋白分泌與menthol及冷刺激組比較沒(méi)有顯著差異(P=0.943，P=0.421)，載體對(duì)照組的MUC5AC蛋白分泌與menthol及冷刺激組比較亦沒(méi)有顯著差異(P=0.486，P=0.139)。
　　結(jié)論：(1)人氣道粘膜上皮組織表達(dá)TRPM8蛋白。COPD患者氣道粘膜上皮組織中，TRPM8 mRNA及蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常人。因TRPM8是一個(gè)特異性的冷敏感

25、受體，可以被低溫激活，故COPD患者氣道粘膜上皮TRPM8蛋白的過(guò)表達(dá)狀態(tài)可能是其對(duì)外界冷空氣相對(duì)較敏感的重要原因之一。(2)menthol及冷刺激均呈時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的顯著升高，BCTC及TRPM8 shRNA的轉(zhuǎn)染可阻斷鈣離子內(nèi)流，而SCFalnble TRPM8 shRNA則對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度沒(méi)有顯著影響。以上結(jié)果證明16HBE細(xì)胞上表達(dá)的TRPM8離子通道具有被冷刺激激活的基本特點(diǎn)，16HBE細(xì)胞通過(guò)TRPM8離

26、子通道感知外界冷刺激。Menthol及冷刺激誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高，緊接著出現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)期，平臺(tái)期的出現(xiàn)預(yù)示著冷刺激激活的TRPM8受體存在脫敏現(xiàn)象。(3)長(zhǎng)時(shí)間的menthol或冷刺激不僅可以誘導(dǎo)黏蛋白的瞬時(shí)高分泌狀態(tài)，menthol或冷刺激還可上調(diào)黏蛋白基因的表達(dá)并導(dǎo)致后續(xù)的黏蛋白合成及分泌相應(yīng)升高。MUC5AC基因表達(dá)的上調(diào)、胞內(nèi)MUC5AC蛋白合成及后續(xù)的MUC5AC蛋白分泌均可能與由冷刺激或menthol誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子及