1、第一部分基于RNA-seq技術(shù)的富頸鱗癌和癌旁組織的差異表達(dá)基因分析
　　目的:
　　宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，居女性癌癥患者死亡原因的第4位。除HPV感染外，被感染細(xì)胞的基因組異常才能最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，因此與細(xì)胞生長分化相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控異常在宮頸癌的發(fā)病機(jī)制中同樣具有重要作用。轉(zhuǎn)錄組是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)。本研究擬應(yīng)用RNA-seq技術(shù)全面分析宮頸鱗癌組織和癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組，篩選出差異表達(dá)基因

2、，進(jìn)而分析差異表達(dá)基因的相互作用、涉及的信號通路、以及差異表達(dá)基因與宮頸鱗癌臨床病理因素的相關(guān)性，尋找可能的宮頸鱗癌診斷的分子標(biāo)記物和靶向治療目標(biāo)，為宮頸癌的診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　構(gòu)建cDNA文庫后，應(yīng)用RNA-seq全面分析3對宮頸鱗癌和對應(yīng)癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組，篩選出宮頸鱗癌組織和癌旁組織的差異表達(dá)基因。應(yīng)用GO(Gene Ontology)方法分析差異表達(dá)基因的功能聚類，應(yīng)用KEGG(Kyoto E

3、ncyclopedia of Genes andGenomes)信號通路富集性方法分析差異表達(dá)基因相關(guān)的信號通路。構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析差異表達(dá)基因之間的相互作用，篩選出重要的差異表達(dá)基因。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化的方法驗(yàn)證宮頸鱗癌組織和癌旁組織的差異基因的表達(dá)水平，并分析差異基因與宮頸鱗癌臨床病理因素的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　3對宮頸鱗癌組織和癌旁組織共有347個差異表達(dá)基因，包括104個表達(dá)一致上調(diào)的基因

4、、148個表達(dá)一致下調(diào)的基因。347個差異表達(dá)基因被分為73個功能聚類，104個表達(dá)一致上調(diào)的差異表達(dá)基因被分為34個功能聚類，148個表達(dá)一致下調(diào)的差異表達(dá)基因被分為80個功能聚類。通過KEGG信號通路富集性分析，我們發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因富集到6條信號通路上，包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號通路、補(bǔ)體系統(tǒng)及凝血相關(guān)信號通路、視黃醇代謝相關(guān)信號通路、趨化因子相關(guān)信號通路、細(xì)胞色素p450外源性物質(zhì)代謝相關(guān)信號通路、黑素原生成相關(guān)信號通

5、路。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)三個重要的差異表達(dá)基因，為RDH12，UBD，SAA1。與癌旁組織相比，RDH12基因在74.5％的宮頸鱗癌組織中表達(dá)下降，與腫瘤直徑及宮頸肌層浸潤深度負(fù)相關(guān)。UBD基因在61.7％的宮頸鱗癌組織中表達(dá)升高，與腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。SAA1基因在57.4％的宮頸鱗癌組織中表達(dá)升高，與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮頸肌層浸潤深度正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　本研究首次利用RNA-seq技術(shù)對宮頸鱗癌和

6、癌旁組織中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了全面分析，發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌與癌旁組織中共有347個差異表達(dá)基因，富集到6個信號通路上，其中差異表達(dá)基因RDH12，UBD，SAA1與宮頸鱗癌臨床病理因素相關(guān)，可能成為宮頸癌診斷和治療的靶基因，但其在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
　　第二部分基于RNA-seq技術(shù)的宮頸鱗癌與癌旁組織的可變剪接分析
　　目的:
　　前體mRNA的可變剪接是真核生物蛋白質(zhì)多樣性的重要調(diào)控機(jī)制。mRNA異

7、常剪接與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，涉及細(xì)胞周期、代謝、及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控?？勺兗艚釉趯m頸鱗癌中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究擬應(yīng)用RNA-seq技術(shù)全面分析宮頸鱗癌組織和癌旁組織中的可變剪接事件、可變剪接基因、可變剪接涉及的信號通路、可變剪接基因與宮頸鱗癌臨床病理因素的相關(guān)性，為宮頸癌的診治提供新的思路。
　　方法:
　　用RNA-seq技術(shù)分析4對宮頸鱗癌和癌旁組織的轉(zhuǎn)錄本信息，用SpliceMap軟件檢測宮頸鱗癌組織和癌旁組織的可變剪接

8、事件，使用Bowtie軟件將每個檢測片段與人類基因組進(jìn)行比對，篩選出宮頸鱗癌特異性的可變剪接事件。應(yīng)用KEGG信號通路顯著性富集方法分析可變剪接事件參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。根據(jù)4個宮頸鱗癌組織中的可變剪接事件mapped reads的數(shù)目，挑選出KLHDC7B和SYCP2基因，并用RT-PCR方法驗(yàn)證可變剪接基因KLHDC7B和SYCP2在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平，并分析可變剪接基因與宮頸鱗癌臨床病理因素的相關(guān)性。
　　結(jié)果:

9、　　根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)，4個宮頸鱗癌組織中共有35個特異性的可變剪接基因。KEGG信號通路富集性分析表明宮頸鱗癌特異性的可變剪接事件富集到16條信號通路上，包括代謝相關(guān)信號通路、細(xì)胞內(nèi)吞作用相關(guān)信號通路、ras信號通路等。KLHDC7B基因存在可變5'剪接位點(diǎn)，該基因在66.0％的宮頸鱗癌組織中表達(dá)升高，與腫瘤直徑正相關(guān)。SYCP2基因存在外顯子跳躍，該基因在38.2％的宮頸鱗癌組織中表達(dá)升高，與宮頸肌層浸潤深度正相關(guān)。