1、成年動物的神經(jīng)元已經(jīng)退出細胞周期，不再具有分裂增殖的能力。有報道認為同源分子SHCI和SHC3在神經(jīng)系統(tǒng)中的分布截然相反，前者僅存在于神經(jīng)干細胞和前體細胞，后者僅存在于分裂后的神經(jīng)元。此發(fā)現(xiàn)為研究神經(jīng)元脫離細胞周期的分子機理提供契機。因此我們希望通過研究SHCI和SHC3對可分裂細胞(如NSC)和不可分裂細胞（如神經(jīng)元）細胞周期的影響，解釋神經(jīng)元為何脫離細胞周期。在此目的下，本文主要探討分別干涉SHC3和SHC1或者分別表達SHC1和S

2、HC3對神經(jīng)元和神經(jīng)干細胞周期的影響，研究過表達SHC1和SHC3及其結構域對PC12細胞周期的影響，揭示SHC3的CH1+SH2結構域促進PC12細胞增殖的分子機理。
　　 本文的研究主要分為以下3部分：
　　 第一部分：SHC1和SHC3對神經(jīng)元和神經(jīng)干細胞周期的影響研究。在研究SHC1和SHC3對神經(jīng)元細胞周期的影響時，我們首先從胎鼠中分離并純化了皮層神經(jīng)元，進一步的SHC3染色顯示神經(jīng)元的純度在99％以上，然后用

3、慢病毒介導的RNAi沉默神經(jīng)元中SHC3 mRNA，用腺病毒在神經(jīng)元中表達SHC1。SHC3mRNA干涉后，部分神經(jīng)元進入細胞周期并伴隨著Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A、CDK2和磷酸化CDK2(p-CDK2)表達高調；表達SHC1后，神經(jīng)元細胞周期沒有發(fā)生變化，但是Cyclin A、CDK2和p-CDK2的表達出現(xiàn)高調。在研究SHC1和SHC3對神經(jīng)干細胞(NSC)周期的影響時，我們首先從胎鼠皮層中分離并鑒定了

4、大鼠NSC，然后用慢病毒介導的RNAi沉默神經(jīng)干細胞中的SHC1，用腺病毒在神經(jīng)干細胞中表達SHC3。SHC1 mRNA干涉后，神經(jīng)干細胞周期被抑制伴隨著Cyclin E和CyclinA表達下調；表達SHC3后，神經(jīng)干細胞發(fā)生細胞周期阻滯并伴隨著Cyclin D1、Cyclin E和Cyclin A表達下調。
　　 第二部分：SHC1、SHC3及其結構域對PC12細胞周期的影響。我們成功克隆了小鼠p52SHC1和p52SHC3的

5、ORF，構建了SHC1、SHC1-PTB、SHC1-PTB+CH1、 SHC1-SH2、 SHC1-CH1+SH2、 SHC3、 SHC3-PTB、SHC3-PTB+CH1、SHC3-SH2、SHC3-CH1+SH2的真核表達載體，利用上述真核表達載體轉染PC12細胞，使用流式細胞術和Western Blot分別檢測了過表達以上蛋白對PC12細胞周期和細胞周期蛋白的影響。通過流式細胞術的檢測，我們發(fā)現(xiàn)在轉染后36h和60h的PC12細胞

6、中，CH1結構域的存在會影響PTB結構域和SH2結構域的功能，因此在比較PTB和SH2結構域的功能時，必須考慮CH1結構域的存在。流式細胞術和Western Blot檢測的結果表明：SHC1提高了CDK2的表達，促使G0/G1期細胞數(shù)目減少，SHC3則降低了Cyclin D1和CyclinA的表達，使細胞滯留在G0/G1期；SHC1的PTB結構域能促進Cyclin D1的表達，降低Cyclin A的表達，但是對G0/G1期細胞數(shù)目影響不

7、明顯，而SHC3的PTB結構域則能降低Cyclin A、Cyclin D1和Cyclin E的表達，使得G0/G1期的細胞比例上升：SHC1和SHC3的SH2結構域均能上調Cyclin D1和Cyclin E的表達，降低G0/G1期細胞的數(shù)量，但是SHC3的SH2結構域還能提高CDK2的表達，因此其造成的細胞學效應要比前者大。比較不同結構域引起的細胞學效應，對不同分子來說，SHC3的PTB結構域和SH2結構域要大于SHC1的相應結構域；

8、在同一分子中，對SHC1來說，SH2結構域和PTB結構域的作用差別不明顯，對SHC3而言，PTB結構域的功能大于SH2結構域。
　　 第三部分：SHC3的SH2結構域影響PC12細胞周期的分子機理。首先我們使用計算生物學的方法預測了CH1結構域以不同方式結合對其與GRB2結合力的影響，結果發(fā)現(xiàn)CH1結構域以正向（從N．末端到C-末端）方式結合的結合能要小于其以反向（從C-末端到N-末端）方式結合的結合能，而GRB2參與的信號通路

9、與細胞增殖正相關，這就導致結合力越大促進細胞增值的能力越強。然后我們使用PCR擴增了SHC3的SH2結構域和CH1結構域，人為將兩者的位置顛倒，即由原來的CHI+SH2（反向）變?yōu)镾H2+CH1（正向），構建了pEGFP-SH2+CH1真核表達載體。最后將pEGFP-CH1+SH2和pEGFP-SH2+CH1轉染PC12細胞，使用Co-IP檢測CHI+SH2以及SH2+CH1與內源性GRB2的結合力差別，流式細胞術和WesternBlo

10、t分別檢測細胞周期和細胞周期相關蛋白的變化。Co-IP檢測顯示，CH1+SH2與GRB2的結合力要遠大于SH2+CH1的結合力。流式細胞術和Western Blot檢測證明CH1+SH2提高了Cyelin D1、Cyclin E和CDK2的表達，促使G0/G1期細胞數(shù)目減少，說明CH1+SH2能促進PC12細胞進入細胞周期，而SH2+ CH1則降低了CyclinA、Cyclin D1和Cyelin E的表達，使G0/G1期細胞數(shù)目增加，

11、說明SH2+ CH1抑制了PC12細胞的增殖。
　　 對比研究SHC1和SHC3對神經(jīng)元和神經(jīng)干細胞周期的影響，我們發(fā)現(xiàn)SHC3在維持神經(jīng)元的靜息狀態(tài)中起著極其重要的作用，它有可能為眾多的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾患的治療提供可能的作用靶點。過表達SHC1、SHC3及其結構域對PC12細胞周期影響的研究初步解釋了在脫離細胞周期中SHC3的PTB結構域對它的功能起著主要作用。對SHC3的SH2結構域影響PC12細胞周期分子機理的研究證