1、本研究分為三個(gè)部分。
　　第一部分 辛伐他汀促進(jìn)BMSCs歸巢并提高其防治橋血管狹窄的功能
　　目的:研究辛伐他汀對(duì)BMSCs的CXCR4表達(dá)及體外、體內(nèi)定向遷移能力的影響，探討辛伐他汀對(duì)干細(xì)胞移植防治橋血管狹窄功能的改善。
　　方法:1.用不同濃度的辛伐他汀(0、0.1、0.33、1μM)刺激BMSCs，48h后通過Westen blot檢測(cè)總蛋白中CXCR4表達(dá)量的變化;辛伐他汀刺激BMSCs48h后，通過流式細(xì)胞

2、術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)變化情況。2.用Transwell小室檢測(cè)BMSCs在辛伐他汀(終濃度1μM)和/或AMD3100(一種抑制CXCR4趨化因子受體拮抗劑，終濃度5μg/mL)作用下向SDF-1α遷移。分為三組:對(duì)照組、辛伐他汀組、AMD3100+辛伐他汀組。通過與對(duì)照組比較研究辛伐他汀在體外對(duì)BMSCs歸巢能力的影響并確定該影響是通過調(diào)節(jié)CXCR4表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)果:Western blot表明，隨著辛伐他汀濃度

3、的增加，BMSCs內(nèi)總CXCR4的表達(dá)逐漸增加，沒有辛伐他汀干預(yù)的情況下最低，辛伐他汀濃度最大時(shí)(1μ M)，表達(dá)量最高。流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀能夠提高BMSCs表面CXCR4的陽性表達(dá)率，辛伐他汀組樣品細(xì)胞表面平均熒光強(qiáng)度強(qiáng)于對(duì)照組樣品細(xì)胞，中位熒光強(qiáng)度較對(duì)照組也有所增強(qiáng)。在SDF-1α趨化作用下，與正常培養(yǎng)BMSCs比，辛伐他汀刺激48h后的BMSCs遷移明顯增加。AMD3100阻斷CXCR4之后，辛伐他汀干預(yù)所引起的BMSCs

4、定向遷移增加受到抑制。細(xì)胞移植至動(dòng)物模型內(nèi)7天后，在橋血管內(nèi)膜處可見大量CM-DiI標(biāo)記的移植細(xì)胞。與單純細(xì)胞移植相比，應(yīng)用辛伐他汀能明顯促進(jìn)BMSCs向移植靜脈橋血管內(nèi)膜處遷移，AMD3100可以抑制這一作用，降低了辛伐他汀對(duì)干細(xì)胞歸巢的促進(jìn)作用。28天后，橋血管新生內(nèi)膜HE染色發(fā)現(xiàn)，較單獨(dú)應(yīng)用干細(xì)胞移植相比聯(lián)合應(yīng)用辛伐他汀及干細(xì)胞移植能夠更有效的減少新生內(nèi)膜的產(chǎn)生。應(yīng)用AMD3100后，辛伐他汀對(duì)干細(xì)胞防治橋血管狹窄作用的改善被削弱

5、。
　　結(jié)論:在辛伐他汀作用下，BMSCs的CXCR4表達(dá)增加，尤其是細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)增加，向SDF-1α趨化遷移能力增強(qiáng)，應(yīng)用AMD3100可以抑制這一增強(qiáng)的趨勢(shì)，進(jìn)一步說明辛伐他汀促進(jìn)BMSCs定向遷移能力是通過促進(jìn)CXCR4表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。在動(dòng)物模型中，辛伐他汀可以促進(jìn)BMSCs在橋血管內(nèi)膜的歸巢，進(jìn)而更好的抑制了新生內(nèi)膜的增生，最終證明辛伐他汀能改善BMSCs移植對(duì)橋血管狹窄的防治功能。
　　第二部分 PI3K/A

6、KT信號(hào)通路參與辛伐他汀引起的CXCR4過表達(dá)
　　目的:研究辛伐他汀促進(jìn)BMSCs過表達(dá)CXCR4的過程中是否有PI3K/AKT通路的參與。
　　方法:1.用不同濃度(0、0.1、0.33、1μM)的辛伐他汀刺激BMSCs，48h后通過Westen blot檢測(cè)AKT及磷酸化AKT表達(dá)量的變化并與CXCR4表達(dá)量變化程度進(jìn)行比較。2.PI3K/AKT通路抑制劑LY294002預(yù)處理間充質(zhì)干細(xì)胞后，再行辛伐他汀干預(yù)，West

7、ern blot觀察CXCR4,AKT及磷酸化AKT三種蛋白的表達(dá)變化情況，分組:對(duì)照組，使用正常完全培養(yǎng)基，不添加LY294002及辛伐他汀;辛伐他汀組，培養(yǎng)基中添加辛伐他汀(終濃度1μM)，培養(yǎng)48小時(shí);PI3K抑制劑+辛伐他汀組，培養(yǎng)基中先加入LY294002(終濃度30μM)培養(yǎng)2小時(shí)以阻斷AKT活化過程，然后加入辛伐他?。ńK濃度1μM），培養(yǎng)48小時(shí);PI3K抑制劑組，培養(yǎng)基中加入LY294002（終濃度30μ M），培養(yǎng)48

8、小時(shí)。
　　結(jié)果:Western blot結(jié)果表明，隨著辛伐他汀濃度不斷增加，p-AKT表達(dá)量逐漸增加，對(duì)照組培養(yǎng)基中未加入辛伐他汀，細(xì)胞內(nèi)p-AKT表達(dá)量最低，該信號(hào)通路活性最低，而當(dāng)辛伐他汀濃度為1μM時(shí)，p-AKT表達(dá)量達(dá)到最大，該通路得到最大程度的激活。p-AKT表達(dá)上升趨勢(shì)與CXCR4表達(dá)上升趨勢(shì)相似，在對(duì)照組中，BMSCs未受到辛伐他汀的干預(yù)作用，兩者的表達(dá)量均為最低，隨辛伐他汀濃度增加，兩者表達(dá)量逐漸增加，在辛伐他汀

9、濃度為1μM時(shí)，兩者表達(dá)量最高，而AKT的表達(dá)無顯著變化。AKT的活化受到LY294002抑制之后，p-AKT表達(dá)下降，CXCR4表達(dá)也隨之下降。辛伐他汀對(duì)p-AKT的表達(dá)的促進(jìn)作用也被抑制劑的預(yù)處理削弱，辛伐他汀對(duì)BMSCs內(nèi)CXCR4過表達(dá)的促進(jìn)作用也被抑制，兩者表達(dá)變化方向一致。應(yīng)用抑制劑之前，辛伐他汀可以明顯的促進(jìn)干細(xì)胞的定向遷移;應(yīng)用抑制劑之后，該促進(jìn)作用明顯降低。與對(duì)照組相比，單獨(dú)應(yīng)用抑制劑并沒有明顯的減輕細(xì)胞的定向遷移，可

10、能跟BMSCs經(jīng)過培養(yǎng)后，CXCR4陽性細(xì)胞明顯減少有關(guān)。
　　結(jié)論:在辛伐他汀作用下，BMSCs內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路激活，磷酸化AKT促進(jìn)CXCR4的表達(dá)。抑制該通路可以抑制CXCR4表達(dá)的同時(shí)也能減弱辛伐他汀對(duì)CXCR4表達(dá)的促進(jìn)作用，進(jìn)而抑制了BMSCs的定向遷移能力。PI3K/AKT通路參與辛伐他汀促進(jìn)CXCR4表達(dá)的過程.
　　第三部分 miR-9參與辛伐他汀引起的CXCR4過表達(dá)，其表達(dá)也受PI3K/AKT

11、/通路調(diào)控
　　目的:研究辛伐他汀干擾BMSCs后，與CXCR4相關(guān)程度高的miRNAs表達(dá)的變化，并驗(yàn)證其是否以CXCR4為靶基因。同時(shí)研究其表達(dá)與PI3K/AKT通路活性的關(guān)系。
　　方法:1.根據(jù)TargetScan5.2,PicTar，及miRanda的預(yù)測(cè)，找出可能以CXCR4為靶基因的miRNA（預(yù)測(cè)結(jié)果顯示具有較好評(píng)分），并以這些miRNA為目標(biāo)進(jìn)行研究。通過RT-qPCR檢測(cè)辛伐他汀作用下這些miRNA表達(dá)的

12、變化，根據(jù)變化水平，篩選出可能相關(guān)的miRNA。2.根據(jù)篩查的miRNA表達(dá)情況我們發(fā)現(xiàn)miR-9表達(dá)下降最明顯，因此，實(shí)驗(yàn)中選miR-9作為研究目標(biāo)。1）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-9的模擬物及抑制物后觀察間充質(zhì)干細(xì)胞CXCR4表達(dá)的變化:a）Westernblot檢測(cè)總蛋白中CXCR4含量，分組為模擬物組（瞬時(shí)轉(zhuǎn)染模擬物Mimics片段）、陰性對(duì)照組（瞬時(shí)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照Negative Control片段）、抑制物組（瞬時(shí)轉(zhuǎn)染抑制物Inhibit

13、or片段）、抑制物陰性對(duì)照組（瞬時(shí)轉(zhuǎn)染抑制物陰性對(duì)照Inhibitor N.C.片段）;b）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表面CXCR4表達(dá)，包括陽性率、平均熒光強(qiáng)度、中位熒光強(qiáng)度，分組為對(duì)照組、模擬物組、抑制物組，各分組處理同上。2）Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-9的抑制物對(duì)BMSCs向SDF-1α定向遷移能力的影響。分組為對(duì)照組（不轉(zhuǎn)染）和抑制物組（瞬時(shí)轉(zhuǎn)染抑制物Inhibitor片段）。3）將含有miR-9靶序列（野生型）及

14、突變序列（突變型）的報(bào)告基因質(zhì)粒與miR-9模擬物/陰性對(duì)照片段共轉(zhuǎn)染進(jìn)BMSCs。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶表達(dá)情況以驗(yàn)證CXCR4是否為miR-9的靶基因。分組:a）野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，僅轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒，b）野生型質(zhì)粒+模擬物轉(zhuǎn)染組，共轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒以及模擬物，c）野生型質(zhì)粒+陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組，共轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒以及陰性對(duì)照片段，d）突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，僅轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒，e）突變型質(zhì)粒+模擬物轉(zhuǎn)染組，共轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒以及模擬物，f）突變型質(zhì)粒+陰性

15、對(duì)照轉(zhuǎn)染組，共轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒以及陰性對(duì)照片段。
　　結(jié)果:根據(jù)TargetScan5.2,PicTar，及miRanda的預(yù)測(cè)，我們對(duì)辛伐他汀刺激后，BMSCs內(nèi)40種miRNA表達(dá)量進(jìn)行了分析，其中miR-21、miR-369-3p、miR-132和miR-9表達(dá)下降，以miR-9下降最為明顯。瞬轉(zhuǎn)后，miR-9的模擬物使BMSCs對(duì)CXCR4的表達(dá)下降，而其抑制物可以促進(jìn)CXCR4的表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，miR-9模擬物能

16、夠抑制BMSCs表面CXCR4表達(dá)，其陽性率降低，平均熒光強(qiáng)度、中位熒光強(qiáng)度也降低，miR-9抑制物可以促進(jìn)BMSCs表面CXCR4的表達(dá)，包括陽性率、平均熒光強(qiáng)度、中位熒光強(qiáng)度較對(duì)照組均有所增強(qiáng)。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，BMSCs向SDF-1α的遷移也被該抑制物增強(qiáng)。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)一步驗(yàn)證了CXCR4為miR-9的靶基因，miR-9可明顯抑制轉(zhuǎn)染野生型報(bào)告質(zhì)粒的細(xì)胞螢火蟲熒光素酶表達(dá)，卻不能明顯抑制轉(zhuǎn)染突變型報(bào)告質(zhì)粒的細(xì)

17、胞螢火蟲熒光素酶表達(dá)。隨著辛伐他汀濃度的增加，miR-9表達(dá)水平逐漸下降，對(duì)照組培養(yǎng)基中未加入無辛伐他汀，細(xì)胞內(nèi)miR-9表達(dá)量最高，而當(dāng)辛伐他汀濃度為1μM時(shí)，miR-9表達(dá)量達(dá)到最低，與磷酸化AKT的表達(dá)趨勢(shì)相反;而通過LY294002抑制PI3K/AKT通路后，較對(duì)照組相比，miR-9表達(dá)顯著增加。
　　結(jié)論:CXCR4是miR-9的靶基因，miR-9的模擬物可以直接抑制BMSCs對(duì)CXCR4的表達(dá)，抑制miR-9的表達(dá)可以