1、一、研究背景
　　 冠心病為內(nèi)科常見(jiàn)病及多發(fā)病,是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要原因之一,全國(guó)每年約有110萬(wàn)人死于冠心病。溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(percutaneouscoronary intervention,PCI)或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypassgraft,CABG)是縮小急性心肌梗死梗塞范圍和改善臨床預(yù)后的最有效方法。但部分患者或動(dòng)物心肌缺血后再灌注,使缺血所致的功能和代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)

2、一步加重,這種現(xiàn)象稱(chēng)為心肌缺血再灌注損傷(myocardialischemia/reperfusion injury,MIRI),臨床表現(xiàn)為在閉塞的冠狀動(dòng)脈再通、梗死區(qū)血液灌流重建后一段時(shí)間內(nèi),有的病例發(fā)生血壓驟降、心功能不全、心律失常甚至猝死等病情惡化的現(xiàn)象。因此,MIRI的發(fā)生機(jī)制與防治越來(lái)越引起人們的關(guān)注,并一直試圖尋找能對(duì)MIRI產(chǎn)生確切保護(hù)作用的藥物。
　　 心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜,而細(xì)胞調(diào)亡是心肌缺血再

3、灌注損傷發(fā)生的重要機(jī)制之一。與細(xì)胞壞死過(guò)程不同,細(xì)胞凋亡又稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡是指有核細(xì)胞在一定條件下通過(guò)啟動(dòng)其內(nèi)部機(jī)制,主要通過(guò)內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞自然死亡過(guò)程。細(xì)胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中的發(fā)生可能與以下因素有關(guān):①活性氧大量生成:再灌注導(dǎo)致大量氧自由基釋放,造成生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化、各種酶蛋白失活及DNA損傷；②細(xì)胞內(nèi)鈣超載:心肌缺血再灌注過(guò)程中,線(xiàn)粒體內(nèi)Ca2+大量聚集,引起線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放,釋放細(xì)胞色素

4、C入胞質(zhì)內(nèi),進(jìn)一步激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶誘致細(xì)胞凋亡。③線(xiàn)粒體損傷:在細(xì)胞凋亡期間,盡管線(xiàn)粒體能維持其超微結(jié)構(gòu)的正常,但事實(shí)上其功能已經(jīng)發(fā)生顯著改變,如線(xiàn)粒體內(nèi)膜通透性增大,線(xiàn)粒體內(nèi)膜的跨膜電位下降,能量合成水平顯著降低。上述因素并不能直接引起細(xì)胞凋亡,而是通過(guò)一定的信號(hào)傳遞方式激活生存或死亡相關(guān)基因,然后將信號(hào)傳遞到核內(nèi)切酶,而執(zhí)行死亡的功能。因此阻斷心肌缺血再灌注損傷中心肌細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠阻止凋亡程序的執(zhí)行,減少心肌細(xì)胞凋

5、亡,防治心肌缺血再灌注損傷。
　　 酸棗仁是鼠李科植物酸棗(Ziziphus psinosa Hu)的干燥成熟種子,具有斂汗,養(yǎng)肝,寧心安神等多種功效。酸棗仁主要含有多種酸棗仁皂苷類(lèi)等化合物。酸棗仁皂苷是酸棗仁的水溶性成分,酸棗仁皂苷A是其中的主要有效成份之一。研究發(fā)現(xiàn),酸棗仁提取物具有調(diào)脂、降壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心律失常、抗心肌缺血、抗心肌細(xì)胞缺氧一復(fù)氧損傷作用。酸棗仁皂甙A具有抑制血管平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖而抗動(dòng)脈粥樣硬化,同

6、時(shí)對(duì)腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用,但是目前對(duì)于其對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制尚未報(bào)道。
　　 二、研究方法
　　 目的:
　　 在整體水平,我們采用建立大鼠在體心肌缺血再灌注模型模擬急性心肌梗死后再灌注損傷的病理生理變化,酸棗仁皂苷A于造模前腹腔注射給藥干預(yù),旨在觀察其抗細(xì)胞凋亡、保護(hù)心肌等作用,并進(jìn)一步探明其作用機(jī)制(主要是其對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cyt

7、C的影響)；在細(xì)胞水平,采用過(guò)氧化氫損傷原代大鼠心肌細(xì)胞建立氧化損傷模型,酸棗仁皂苷A預(yù)處理后觀察其對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞凋亡的影響,探明其抑制細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制(主要是與PKCε信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系),為臨床上有效防治心肌缺血再灌注損傷提供新思路。本課題分三個(gè)部分進(jìn)行:第一部分酸棗仁皂苷A預(yù)處理對(duì)大鼠缺血再灌注是否有保護(hù)作用,重點(diǎn)觀察其抗氧化作用及其對(duì)心肌組織結(jié)構(gòu)、心肌損傷標(biāo)志物、再灌注心律失常及心功能的影響；第二部分酸棗仁皂苷A預(yù)處理對(duì)

8、缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響,從蛋白質(zhì)水平觀察酸棗仁皂苷A的抗凋亡作用,并探求其作用機(jī)制；第三部分觀察酸棗仁皂苷A對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡及PKCε表達(dá)的影響,進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 第一部分:采用結(jié)扎(15 min)和松開(kāi)(30 min)左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)的方法制備心肌缺血再灌注損傷模型。44只雄性wistar大鼠隨機(jī)分為4組,分別為假手術(shù)組(n=8)、模型組(n=12)、酸棗

9、仁皂甙A組(n=12)及表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯組(n=12)。酸棗仁皂苷A組及EGCG組的給藥劑量均為20mg·kg-1·d-1,假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水,均為腹腔注射,連續(xù)用藥3d,末次給藥30min后進(jìn)行造模。Ⅱ?qū)?lián)心電圖觀察再灌注30min期間心律失常的發(fā)生情況,根據(jù)Roringerova T方法進(jìn)行室性心律失常(ventricular arrhythmias,VA)評(píng)分,Medlab6.0生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)監(jiān)測(cè)左

10、心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、收縮期左心室內(nèi)壓上升的最大變化速率(+dp/dtmax)、舒張期左心室內(nèi)壓下降的最大變化速率(-dp/dtmax)分別在缺血前、缺血15min、再灌注15、30min時(shí)的變化。標(biāo)本收集:實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腹主動(dòng)脈采血,同時(shí)在心底部將心臟與大血管及組織離斷,取出心臟,去除左右心房及右心室,心肌置入冰生理鹽水中沖洗3次,將左心室分離為三部分,一部分用精密電子天平稱(chēng)取記錄質(zhì)量,剪碎勻漿,作為SOD

11、、MDA檢測(cè)用,一部分放入4％多聚甲醛中固定,作為組織切片備用,以觀察心肌組織病理結(jié)構(gòu),另一部分放入-80℃冰箱中保存?zhèn)?；血液室溫靜放30min,在4℃離心后,取其上清置-80℃冰箱保存,檢驗(yàn)肌酸磷酸激酶(CK)及乳酸脫氫酶(LDH)水平。
　　 第二部分:40只雄性wistar大鼠隨機(jī)分為4組,每組10只,分別為假手術(shù)組、模型組、酸棗仁皂甙A組及表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯組,其余同第一部分。以末端脫氧核昔酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)

12、的脫氧三磷酸尿昔(dUTP)缺口末端標(biāo)記法(TdT—mediated du Tpniekend labeling,TUNEL)檢測(cè)凋亡心肌細(xì)胞,計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)；取出-80℃冰箱中保存的部分心肌,提取蛋白及定量后,采用蛋白印跡法檢測(cè)Bax、CytC及Bcl-2表達(dá),采用分光光度法檢測(cè)caspase-3的活性。
　　 第三部分:采用差速貼壁法分離培養(yǎng)Wistar新生乳鼠心肌細(xì)胞,以過(guò)氧化氫作

13、用心肌細(xì)胞建立氧化損傷模型,將培養(yǎng)72 h的原代心肌細(xì)胞,選擇搏動(dòng)良好、生長(zhǎng)密度無(wú)明顯差異的細(xì)胞按孔隨機(jī)分為以下4組:①對(duì)照組:細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不給予任何處理;②模型組:心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中加終濃度為500μmol/L過(guò)氧化氫作用4h；③酸棗仁皂苷A治療組:操作同模型組,但在給予H2O2前加入酸棗仁皂苷A至終濃度為20mg/l干預(yù)24小時(shí);④PKC抑制劑組(JA+Chelerythrine):操作同治療組,但在給予H2O2前5min加入Che

14、lerythrine至終濃度5umol/L。倒置顯微鏡觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)和搏動(dòng)頻率的變化；四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞活力；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；采用分光光度法檢測(cè)caspase-3的活性；蛋白印跡檢測(cè)CtyC及PKCε表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x±s表示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析處理,方差齊性時(shí)兩兩比較采用LSD法；方差不齊時(shí),多組數(shù)據(jù)間比較采

15、用Welch法,兩兩比較采用Games—Howell法。各實(shí)驗(yàn)組缺血前及缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)心功能指標(biāo)采用重復(fù)測(cè)量方差分析。檢驗(yàn)顯著性水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:
　　 1、大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)HE染色光鏡下觀察顯示,假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列整齊,肌纖維完整,未見(jiàn)心肌細(xì)胞水腫、變性、壞死,未見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組心肌細(xì)胞排列紊亂,局部肌纖維橫紋消失,腫脹明顯,較多的中性粒細(xì)胞浸

16、潤(rùn)。酸棗仁皂苷A治療組可見(jiàn)心肌細(xì)胞水腫及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),但都較模型組輕,心肌受損程度有所下降；EGCG組心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化與酸棗仁皂苷A治療組相似。
　　 2、缺血再灌注對(duì)大鼠LDH、CK、SOD及MDA的影響再灌注結(jié)束后檢測(cè)各組LDH、CK、SOD及MDA值。結(jié)果顯示,I/R組、JA組、EGCG組的LDH及CK值均較Sham組明顯增高(P<0.01)；各組SOD值均顯著降低,與Sham組比較有顯著性差異(P<0.01)；各

17、組MDA值均顯著增高,與Sham組相比有顯著性差異(P<0.01)。表明缺血再灌注可造成心肌嚴(yán)重?fù)p傷,證實(shí)心肌缺血再灌注模型構(gòu)建成功。
　　 3、酸棗仁皂甙A對(duì)缺血再灌注大鼠LDH、CK、SOD及MDA的影響經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),各組間LDH、CK、SOD及MDA的水平均有顯著差異(LDH:F=69.104,P=0.000；CK:F=143.320,P=0.000；SOD:F=101.844,P=0.000；MDA:F=212.780,

18、P=0.000)。JA和EGCG均可明顯抑制再灌注所導(dǎo)致的LDH、CK、MDA的升高,同時(shí)顯著增加SOD的活性,與I/R組相比有顯著性差異(P<0.01)；上述指標(biāo)在JA組與EGCG組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),表明JA和EGCG均具有抗氧化作用而減輕心肌缺血再灌注損傷。
　　 4、再灌注心律失常44只大鼠中12只被排除,剩余32只中26只發(fā)生心律失常,心律失常多出現(xiàn)于再灌注早期,包括室性早博、室性心動(dòng)過(guò)速和心室纖顫等；假手

19、術(shù)組僅有偶發(fā)室性早搏,未見(jiàn)其他類(lèi)型心律失常。模型組均出現(xiàn)嚴(yán)重的心律失常,以頻繁室速、室顫為主,伴有少量的房室傳導(dǎo)阻滯,其中2只大鼠因?yàn)槭翌澏劳觥＝?jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),各組間心律失常評(píng)分差異顯著(F=44.699,P=0.000)。與假手術(shù)組比較,模型組心律失常評(píng)分顯著上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。酸棗仁皂苷A治療組也出現(xiàn)了心律失常,以室早及室速為主,與模型組比較心律失常評(píng)分顯著下降(P=0.005)。EGCG組的心律失常以室早及

20、陣發(fā)室速為主,與酸棗仁皂苷A組比較,心律失常評(píng)分無(wú)顯著性差異(P=0.080)。5、心功能指標(biāo)各組缺血前的INSP、LVEDP和±dp/dtmax差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。缺血再灌注時(shí)各組間大鼠左室收縮末壓(LVSP)由高到低依次為Sham組、EGCG組、酸棗仁皂苷A組及I/R組；等容收縮期左心室最大上升速率(+dp/dtmax)及等容舒張期左心室下降最大速率(-dp/dtmax)由高到低依次為Sham組、酸棗仁皂苷A組、EGC

21、G組及I/R組；左室舒張末壓(LVEDP)由低到高依次為Sham組、EGCG組、酸棗仁皂苷A組及I/R組。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,缺血再灌注時(shí)個(gè)組間LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVEDP差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。不同缺血再灌注時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果表明,LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax隨著時(shí)間延長(zhǎng)而降低,LVEDP隨著時(shí)間延長(zhǎng)而升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各時(shí)間點(diǎn)與組別間有交互作用(P<0.01

22、)。以上結(jié)果表明缺血再灌注可導(dǎo)致心臟收縮及舒張功能受損,酸棗仁皂苷A可改善大鼠收縮及舒張功能。
　　 第二部分:
　　 1、各組心肌組織TUNEL結(jié)果按試劑盒提供的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法原位檢測(cè)凋亡細(xì)胞。正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色；凋亡心肌細(xì)胞核呈深淺不一的棕褐色。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),各組間AI差異顯著(F=198.001,P=0.000)。I/R組AI為(18.14±2.22)％,JA和EGCG預(yù)處理后AI顯著下降(

23、P<0.01)；與Sham組比較,JA組和EGCG組中AI顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 2、Western bloting檢測(cè)各組大鼠心肌Bcl-2、Bax及細(xì)胞色素C的表達(dá)通過(guò)分析目的條帶的光密度值(IOD)發(fā)現(xiàn),各組間Bcl—2、Bax、Bcl-2/Bax及細(xì)胞色素C的表達(dá)均有顯著差異(Bcl-2:F=22.463,P=0.000;Bax:F=82.507,P=0.000；Bcl-2/Bax:F=31

24、.350,P=0.000；細(xì)胞色素C:F=96.916,P=0.000)。在Sham組中心肌組織有一定量的Bcl-2及Bax表達(dá),胞漿中細(xì)胞色素C的含量極少,I/R組心肌Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少(P=0.000),而B(niǎo)ax及胞漿中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)顯著增加,Bcl—2/Bax比值顯著降低(P<0.01)；JA組和EGCG組中Bax及胞漿中細(xì)胞色素C表達(dá)較I/R組顯著下降(P<0.01),但Bcl—2的表達(dá)較I/R組顯著升高(P<0.0

25、1),Bcl—2/Bax比值顯著高于I/R組(P<0.01)。JA組與EGCG組中的Bcl—2、Bax、胞漿中CytC表達(dá)及Bcl—2/Bax比值無(wú)顯著性差異(P>0.05)；此兩組中Bax表達(dá)與Sham組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05),Bcl-2、胞漿中CytC表達(dá)及Bcl—2/Bax比值與Sham組比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　 3、各組caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果caspase-3活性測(cè)定顯示,各組間casp

26、ase-3活性差異顯著(F=39.663,P=0.000)。正常心肌細(xì)胞的caspase-3活性水平很低,在體缺血15分鐘,再灌注30分鐘后心肌caspase-3的活性顯著升高(P=0.000)；經(jīng)過(guò)JA及EGCG預(yù)處理后心肌caspase-3的活性顯著減少(P<0.01),但JA組與EGCG組的caspase-3活性間無(wú)顯著性差異(P=0.817)。
　　 第三部分:
　　 1、各組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下觀察,

27、正常心肌細(xì)胞從72h起細(xì)胞成單層成簇生長(zhǎng),心肌細(xì)胞核折光性好,偽足飽滿(mǎn)并相互連接,生長(zhǎng)呈半融合狀態(tài),搏動(dòng)明顯,節(jié)律一致,60～80次/min；模型組細(xì)胞核暗淡,偽足顯著變細(xì),細(xì)胞間連接明顯減少,搏動(dòng)節(jié)律減慢,20～30次/min；與模型組比較,酸棗仁皂苷A治療組心肌細(xì)胞形態(tài)明顯改善,細(xì)胞核折光性較好,偽足略變細(xì),搏動(dòng)有力,節(jié)律一致,50～60次/min；與酸棗仁皂苷A治療組比較,PKC抑制劑組心肌細(xì)胞細(xì)胞核折光性較差,偽足變細(xì),細(xì)胞間連

28、接減少,搏動(dòng)節(jié)律減慢,30～40次/min。
　　 2、各組心肌細(xì)胞活力與細(xì)胞凋亡的結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),各組間心肌細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡差異顯著(心肌細(xì)胞活力:P=87.752,P=0.000；細(xì)胞凋亡:F=657.061,P=0.000)。與對(duì)照組比較,模型組心肌細(xì)胞活力顯著降低(P=0.000),細(xì)胞凋亡率則顯著增加(P=0.000)；與模型組比較,JA組心肌細(xì)胞活力顯著增加(P=0.000),細(xì)胞凋亡率則顯著降低(P=0.000

29、)；與JA組比較,PKC抑制劑組心肌細(xì)胞活力顯著降低(P=0.008),細(xì)胞凋亡率則顯著增加(P=0.000)。
　　 3、Western blot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞CtyC及PKCε的表達(dá)情況經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)瞼驗(yàn),各組間CtyC及PKCε的表達(dá)差異顯著(CtyC:F=210.511,P=0.000:PKCε:F=42.589,P=0.000)。與對(duì)照組比較,模型組胞漿中細(xì)胞色素C顯著增多(P=0.000),PKCε表達(dá)無(wú)顯著性差異(P=

30、O.235)；JA預(yù)處理后,細(xì)胞色素C表達(dá)顯著減少(P=0.000),PKCε表達(dá)顯著升高(P=0.000)；與JA組比較,PKC抑制劑組胞漿中細(xì)胞色素C顯表達(dá)顯著增多(P=0.000),PKCε表達(dá)顯著降低(P=0.000)。
　　 4、各組caspase-3活性檢測(cè)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),各組間caspase-3活性差異顯著(F=663.629,P=0.000)。與對(duì)照組比較,模型組Caspase-3的活性顯著增加(P=0.000)；

31、與模型組比較,JA組的Caspase-3活性顯著降低(P=0.000)；Chelerythrin干預(yù)后,Caspase-3活性顯著升高(P=O.000)。
　　 結(jié)論:
　　 1、本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在體大鼠心肌缺血/再灌注模型,證實(shí)了心肌缺血/再灌注可導(dǎo)致心肌損傷,酸棗仁皂苷A預(yù)處理可以減輕心肌的損傷,降低LDH、CK、MDA值,升高SOD值,減少再灌注心律失常,改善心功能。
　　 2.心肌缺血/再灌注和過(guò)氧化氫損傷可以

32、引起心肌細(xì)胞凋亡,酸棗仁皂苷A預(yù)處理可以減少心肌細(xì)胞凋亡。因此酸棗仁皂苷A可減輕心肌缺血再灌注損傷,與其抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　 3.酸棗仁皂苷A預(yù)處理可以上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax蛋白表達(dá),升高Bcl-2/Bax比值,抑制細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體中的釋放,減少caspase-3在心肌組織中活性從而減少心肌細(xì)胞凋亡。
　　 4.PKC是預(yù)適應(yīng)機(jī)制的重要環(huán)節(jié),酸棗仁皂苷A預(yù)處理可增強(qiáng)心肌細(xì)胞膜PKCε的蛋白表達(dá),經(jīng)Chele