1、中樞性性早熟(centralprecociouspuberty，CPP)是下丘腦-垂體-性腺軸提前發(fā)動(dòng)，性腺發(fā)育，分泌性激素，使患兒骨生長(zhǎng)板過(guò)早性激素暴露(接觸)，骨成熟加速-骨齡提前，使青春期生長(zhǎng)時(shí)間縮短而對(duì)成年身高帶來(lái)負(fù)面影響，成年身高不能達(dá)到遺傳靶身高(targetHeight，THt)。改善成年身高是CPP治療的y要目標(biāo)之一，理想的藥物應(yīng)能促進(jìn)長(zhǎng)骨生長(zhǎng)/成熟的正平衡。促性腺激素釋放激素?cái)M似物(gonadotropinreleas

2、inghormorleagonist，GnRHa)是近年用于改善中樞性性早熟患兒成年終身高的豐要藥物，它因能有效抑制性腺發(fā)育，性激素分泌減少而延緩骨齡增長(zhǎng)，但治療過(guò)程中可致牛長(zhǎng)減速，減速?lài)?yán)重者可而成為影響療效的癥結(jié)。目前主要應(yīng)用基因重組生長(zhǎng)激素(recombinantgrowthhormone，rhGH)克服減速，但其價(jià)格極其昂貴。蛋白同化類(lèi)固醇激素(anabolic-androgenicsteroids，AS)能促進(jìn)長(zhǎng)骨線(xiàn)性生長(zhǎng)，但應(yīng)

3、用不當(dāng)時(shí)可使骨成熟加速，對(duì)終身高呈負(fù)面影響，其機(jī)制未明。本研究以GnRHa處理的青春期個(gè)體為對(duì)象，以注射了GnRHa的青春期大鼠生長(zhǎng)板的軟骨細(xì)胞進(jìn)行離體和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以及CPP患兒的臨床研究，探討蛋白同化類(lèi)固醇激素對(duì)青春期發(fā)育個(gè)體GnRHa處理后對(duì)生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制，為尋求生長(zhǎng)激素以外克服GnRHa治療中生長(zhǎng)減速有效、安全而且經(jīng)濟(jì)的另一臨床治療選擇奠定理論基礎(chǔ)。 第一部分蛋白同化類(lèi)固醇激素對(duì)GnRHa處理后青春期大鼠生長(zhǎng)板軟骨

4、細(xì)胞增殖和分化的影響及機(jī)制探討 (一)目的: (1)探索高效合理的大鼠長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞分離方法和體外培養(yǎng)條件，建立一種理想的軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。對(duì)分離培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)特性進(jìn)行觀察，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供條件。 (2)應(yīng)用AS制劑司坦唑醇(stanozolol，ST)研究其對(duì)離體培養(yǎng)的GnRHa處理后青春期大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的增殖、成熟和分化的影響。探索ST促進(jìn)生長(zhǎng)/成熟正平衡的量、時(shí)效關(guān)系。 (3

5、)離體研究司坦唑醇對(duì)GnRHa處理后青春期大鼠與促進(jìn)生長(zhǎng)有密切關(guān)系的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)mRNA表達(dá)和IGF-1合成分泌的影響。 (4)離體實(shí)驗(yàn)探索司坦唑醇經(jīng)由雌激素受體α(ERα)、雄激素受體(AR)、IGF-1受體(IGF-1R)介導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖/分化的途徑，以及兩種受體與生長(zhǎng)因子受體后信號(hào)通路的交互影響(cross-talk)，以探討ST促進(jìn)骨生長(zhǎng)/成熟生物效應(yīng)的分子層面的可能機(jī)制。 (

6、5)通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬方法預(yù)測(cè)司坦唑醇與ERα的相互作用方式，探討ERα與司坦唑醇和雌二醇相互作用方式的同異。 (二)材料和方法:1.軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)鑒定雌鼠3周齡末時(shí)斷乳并開(kāi)始肌注GnRHa制劑曲普瑞林，每2周一次，共2次，7周末時(shí)處死，無(wú)菌取出脛骨生長(zhǎng)板。采用二次酶消化法獲得軟骨細(xì)胞，觀察軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)特性，行軟骨細(xì)胞鑒定并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。 2.司坦唑醇對(duì)體外培養(yǎng)GnRHa處

7、理后青春期大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖和成熟分化的影響將原代軟骨細(xì)胞接種于96孔板和24孔板，常規(guī)培養(yǎng)48小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞饑餓24小時(shí)，之后時(shí)效組(0、1、2、3、4、5天)中ST組培養(yǎng)基內(nèi)加入司坦唑醇(終濃度10-8M)分別培養(yǎng)，量效組于培養(yǎng)液中加入不同濃度的ST(0、10-11M、10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M)作用48小時(shí)，通過(guò)MTT法和免疫組化法檢測(cè)軟骨細(xì)胞核增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、胞漿中I

8、I型膠原(軟骨細(xì)胞增殖指標(biāo))、X型膠原(軟骨細(xì)胞分化成熟指標(biāo))的表達(dá)，了解司坦唑醇對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響和時(shí)效、量效的關(guān)系。 3.司坦唑醇對(duì)GnRHa處理后青春期大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞IGF-1mRNA表達(dá)及其蛋白合成分泌的影響按3×105個(gè)細(xì)胞/皿的密度將原代軟骨細(xì)胞懸液接種于35mm的培養(yǎng)皿，于接種72小時(shí)后首次更換培養(yǎng)基，之后每2天更換1次至70～80％融合，再用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，次日進(jìn)行ST干預(yù)。按時(shí)效組和量效組不同時(shí)

9、間行ST劑量處理，IGF-1mRNA表達(dá)時(shí)效組ST濃度均為10-7M，于0、2～16小時(shí)共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，量效組(0、10-11IM～10-5M，8個(gè)濃度點(diǎn))作用時(shí)間8小時(shí)，完成處理后收取各組的細(xì)胞進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)IGF-1mRNA。 IGF-1蛋白合成分泌時(shí)效組ST濃度均為10-7M，于0、5～40小時(shí)共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，量效組(0、10-11M～10-5M，8個(gè)濃度點(diǎn))作用時(shí)間20小時(shí)，完成處理后取細(xì)胞上清液濃縮后以E

10、LISA法測(cè)定IGF-1，并對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。 4.IGF-1R、ERα和AR-受體后信號(hào)及其間交聯(lián)作用對(duì)ST促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖分化機(jī)制的研究將原代軟骨細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板及24孔板，分別用4個(gè)阻斷劑，AR阻斷劑(BIC)、ER阻斷劑(ICI182.780)、IGF-1受體(IGF-1R)阻斷劑(AG1024)、絲裂原激活蛋白激酶激酶(MAPKK)阻斷劑(PD98059)。每個(gè)阻斷劑設(shè)置三個(gè)濃度。常規(guī)培養(yǎng)72小時(shí)后換成0.02

11、％無(wú)激素胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞饑餓，饑餓24小時(shí)后預(yù)先在ST+阻斷劑組、單純阻斷劑組中加入各阻斷劑后再在單純ST組、ST+阻斷劑組再加入ST(司坦唑醇最終濃度為10-8M)，無(wú)藥對(duì)照組則繼續(xù)用0.02％胎牛血清培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)72小時(shí)后取出進(jìn)行MTT比色及PCNA免疫組化。 5.分子動(dòng)力學(xué)模擬方法對(duì)司坦唑醇與雌激素受體α相互作用方式的研究依據(jù)已知的雌激素受體蛋白ERα的三維晶體結(jié)構(gòu)，通過(guò)基于AMBER立場(chǎng)的分子動(dòng)力學(xué)模擬方法來(lái)

12、預(yù)測(cè)雌激素受體α與司坦唑醇的相互作用方式，使用MM-PBSA方法模擬計(jì)算雌激素受體α和司坦唑醇的結(jié)合自由能，并從動(dòng)力學(xué)的角度探索并解釋了雌激素受體蛋白ERα與小分子相互作用和識(shí)別機(jī)制。 第二部分蛋白同化類(lèi)固醇激素對(duì)GnRHa處理后青春期大鼠生長(zhǎng)影響的實(shí)驗(yàn)研究 (一)目的:經(jīng)在體動(dòng)物研究，觀察GnRHa處理后的青春期大鼠ST對(duì)軟骨生長(zhǎng)板的生長(zhǎng)和成熟的影響，探索ST促進(jìn)長(zhǎng)骨生長(zhǎng)和成熟平衡的量、時(shí)效關(guān)系。 (二)材料

13、和方法:正常清潔級(jí)SD雌鼠3周齡末時(shí)斷乳，量效組按隨即區(qū)組(同窩)設(shè)計(jì)(每窩7只)分為7組(6只/組)，分別為5000ug/100g、200ug/100g、100ug/100g、50ug/100g、25ug/100g、溶劑對(duì)照組、空白對(duì)照組。時(shí)效組按隨即區(qū)組(同窩)設(shè)計(jì)(每窩8只)分為8組(6只/組)分別為：2天組、3天組、5天組、7天組、10天組、13天組、溶劑對(duì)照組、空白對(duì)照組。并開(kāi)始肌注GnRHa，每2周一次，共2次，在第二次注射

14、GnRHa3天(D1)后開(kāi)始干預(yù)處理：(1)量效組于D1～D13分別每日注射相應(yīng)劑量的ST。(2)時(shí)效組按療程長(zhǎng)短分別于D1～D13(13天組)、D1～D10(10天組)、D1～D7(7天組)、D1～5(5天組)、D1～3(3天組)、D1～2(2天組)接受劑量為100ug/100gST注射處理。溶劑對(duì)照組于D1～D13只接受等量注射大豆油，空白對(duì)照組不進(jìn)行任何處理。所有大鼠于D14處死。比較接受不同處理的大鼠體重增長(zhǎng)、鼻肛長(zhǎng)度增長(zhǎng)、脛骨

15、長(zhǎng)度、脛骨生長(zhǎng)板HE染色進(jìn)行生長(zhǎng)板的寬度、增殖區(qū)的寬度、肥大區(qū)寬度、增殖區(qū)軟骨細(xì)胞數(shù)、肥大區(qū)軟骨細(xì)胞數(shù)的分析、PCNA免疫組化半定量分析及血清IGF-1濃度檢測(cè)。 第三部分(臨床部分) (一)目的:臨床研究(1)探討不完全性CPP(又稱(chēng)單純性乳房早發(fā)育)向完全性CPP轉(zhuǎn)化的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素。 (2)前瞻分析CPP患兒在GnRHa治療中出現(xiàn)生長(zhǎng)減速時(shí)司坦唑醇對(duì)克服減速的療效。 (二)材料和方法:1對(duì)象和方法

16、縱向回顧分析中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院1995-2005近十年確診為PT的151例患兒的臨床及實(shí)驗(yàn)診斷資料中與轉(zhuǎn)化相關(guān)的因素。 2對(duì)象和方法分析在我院確診特發(fā)性CPP并接受了曲普瑞林(達(dá)菲林)治療的女性患兒30例，分3組，①單獨(dú)GnRHa組②GnRHa+ST組③GnRHa+GH組。GnRHa+ST組為前瞻性研究，單獨(dú)GnRHa組和GnRHa+GH為回顧配對(duì)組，配對(duì)原則是在曲普瑞林治療過(guò)程中均出現(xiàn)生長(zhǎng)減速(GV<4cm/年)，且骨齡達(dá)1

17、0.5～14歲。達(dá)菲林50～100μg/kg，每隔28天一次。ST30μg/kg/d，連續(xù)服用三個(gè)月后停三個(gè)月；GH采用金磊賽增(長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司)，劑量1U/kg.w，分6～7次，睡前皮下注射；單獨(dú)達(dá)菲林治療組在出現(xiàn)減速后繼續(xù)應(yīng)用達(dá)菲林，不加任何藥物。觀察時(shí)間為從研究開(kāi)始共6個(gè)月。比較各組研究前后乳房大小及陰毛發(fā)育情況、生長(zhǎng)速度的改變、骨齡進(jìn)展情況、按骨齡判斷的身高標(biāo)準(zhǔn)差分值(HtSDSba)、預(yù)測(cè)成年身高(PAH)、按遺傳靶