1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是全球終末期腎臟疾病的首要原因。實(shí)驗(yàn)性DN證實(shí)，腎小球固有細(xì)胞缺失和系膜細(xì)胞凋亡與蛋白尿惡化有關(guān)。先前的研究表明，高糖(high glucose，HG)誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡引起系膜細(xì)胞缺失是導(dǎo)致糖尿病腎損傷的主要機(jī)制。
　　高糖通過產(chǎn)生糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)、激活蛋白激酶C(protein kinase

2、 C，PKC)、增加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、GTP結(jié)合蛋白和細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)表達(dá)等途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ROS是各種途徑的共同特征，也是高血糖損傷機(jī)制的核心。正常情況下，ROS受內(nèi)源性抗氧化劑系統(tǒng)控制，包括維生素C、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶等。當(dāng)ROS與抗氧化劑之間的平衡被打破時(shí)即發(fā)生氧化應(yīng)激。過多的

3、ROS通過氧化膜磷脂、蛋白和核酸觸發(fā)凋亡通路并最終引起細(xì)胞死亡。我們最近的研究表明，抗氧化劑Tempol或敲低TXNIP能夠抑制HG誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡、ROS產(chǎn)生和p38 MAPK及ASK1活化。以上研究結(jié)果表明，高糖通過氧化劑依賴機(jī)制誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡。
　　ROS產(chǎn)生的主要部位是線粒體，在糖尿病血管并發(fā)癥中起著重要作用。SS-31肽(D-Arg-2’，6’-dimethyltyrosine-Lys-Phe-NH2

4、)屬于小分子可滲透細(xì)胞的肽家族，靶向聚集在ROS產(chǎn)生的部位--線粒體內(nèi)膜。SS-31能夠清除細(xì)胞內(nèi)ROS和減少線粒體ROS產(chǎn)生，從而防止線粒體通透性改變(mitochondrial permeability transition，MPT)和細(xì)胞色素C釋放。以往的研究表明，SS-31能夠抑制單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡和腎小管損傷。高糖處理人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，SS-31能減少細(xì)胞凋亡和線粒體ROS產(chǎn)生、穩(wěn)定線粒體膜電位(△

5、Ψm)、減少細(xì)胞色素C由線粒體向胞漿釋放和caspase-3表達(dá)。然而，SS-31在HG誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡中的作用是未知的。
　　我們推測(cè)，SS-31能夠通過減少線粒體ROS產(chǎn)生和防止線粒體氧化損傷，從而抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在本研究中，我們應(yīng)用體外培養(yǎng)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞(mouse mesangial cells，MMCs)觀察了SS-31對(duì)HG誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙和p38 MAPK及ASK1

6、活化的影響。
　　方法：小鼠系膜細(xì)胞(MMCs，ATCC no.CRL-1927)來自美國(guó)菌種保藏中心(Manassas，VA)。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10％胎牛血清，2 mM L-谷氨酰胺，100 IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基中，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待MMCs達(dá)75％～85％融合后，用無血清培養(yǎng)基同步細(xì)胞24 h。細(xì)胞分組如下：正常糖組NG(5.6 mM)，NG+甘露醇組(24.4

7、 mM)作為滲透對(duì)照，高糖組HG(30 mM)，HG+SS-31組(100 nM)。于刺激48h后收集細(xì)胞及上清液，進(jìn)行以下檢測(cè)：采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediateddUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位及線粒體ROS產(chǎn)生；Western blot檢測(cè)ca

8、spase-3、Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p38 MAPK、p-p38 MAPK、ASK1、P-ASK1、TXNIP、TRX-2及細(xì)胞色素C的表達(dá)；real-time PCR檢測(cè)TXNIP、TRX-2 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.SS-31對(duì)高糖誘導(dǎo)小鼠系膜細(xì)胞凋亡的影響
　　TUNEL和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與正常糖對(duì)照組(NG)相比，高糖組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加；與高糖組相比，

9、SS-31干預(yù)能夠顯著減少高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。與NG組相比，高糖組Cleaved caspase-3表達(dá)和Bax/Bcl-2比率顯著增加；SS-31干預(yù)能夠顯著抑制HG誘導(dǎo)的Cleavedcaspase-3表達(dá)和Bax/Bcl-2比率。甘露醇對(duì)細(xì)胞凋亡，Cleaved caspase-3表達(dá)和Bax/Bcl-2比率無影響。
　　2.SS-31對(duì)HG誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C釋放的影響
　　與NG組相比，高糖組胞漿中的細(xì)胞

10、色素C水平明顯增加；與高糖組相比，SS-31干預(yù)組細(xì)胞胞漿中細(xì)胞色素C水平明顯降低。甘露醇組與NG組相比，胞漿中細(xì)胞色素C水平無明顯差異。
　　3.SS-31對(duì)HG誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞ROS產(chǎn)生及△Ψm的影響
　　高糖組系膜細(xì)胞ROS表達(dá)較NG組顯著升高；SS-31干預(yù)組細(xì)胞ROS表達(dá)明顯低于高糖組。與NG組相比，高糖組系膜細(xì)胞△Ψm明顯下降；SS-31干預(yù)組細(xì)胞△Ψm與高糖組相比明顯升高。甘露醇組與NG組相比，ROS及△Ψm水平

11、無明顯差別。
　　4.SS-31對(duì)HG誘導(dǎo)系膜細(xì)胞TXNIP和TRX-2表達(dá)的影響
　　HG處理系膜細(xì)胞48 h后，TXNIP mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)；SS-31干預(yù)組能夠顯著抑制HG誘導(dǎo)的TXNIP mRNA及蛋白的表達(dá)。與NG組相比，高糖組TRX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)無明顯改變；與高糖組相比，SS-31干預(yù)組系膜細(xì)胞TRX-2mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高。甘露醇組與NG組相比，TXNIP和TRX-2 mRN

12、A和蛋白水平無明顯差別。
　　5.SS-31對(duì)高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞p38 MAPK和ASK1的激活的影響
　　與NG組相比，HG組p38 MAPK和ASK1的激活顯著增加；而SS-31處理顯著抑制HG誘導(dǎo)的p38 MAPK和ASK1磷酸化。甘露醇組與NG組相比，p38 MAPK和ASK1磷酸化水平無明顯差異。
　　結(jié)論：SS-31通過減少ROS產(chǎn)生，保護(hù)線粒體功能，抑制TXNIP表達(dá)和p38MAPK及ASK1激活，并增加T