1、目的:研究高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞(mesangial cell,MC)內氧化應激狀態(tài)與錳超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase,MnSOD)表達的關系及其可能的分子機制。
　　 方法:本實驗主要通過體外高糖培養(yǎng)大鼠MC進行研究。設立正常組(NS組)、甘露醇組(MA組)、高糖組(HG組)、溶媒對照組(DMSO組)、過氧化氫組(H2O2組)、TGF-β1抑制劑組(SB431542組)、過氧化氫與TGF-β1

2、抑制劑共培養(yǎng)組(HS組)、抗氧化劑組(NAC組)、PI3K抑制劑組(LY-294,002組)。按需要,分別在培養(yǎng)16 h時檢測以下各項指標:流式細胞儀檢測細胞中ROS的水平(HG組檢測4h、10h、16h、28h4個時間點);RT-PCR法測定TGF-β1 mRNA、MnSOD mRNA的相對含量;Western blot法測定細胞中Akt,p-Akt,FoxO3a,p-FoxO3a,MnSOD蛋白表達水平;可見光分光光度法測定胞漿T-

3、SOD和MDA抗氧化指標的水平。
　　 結果:所有結果均顯示,NS組與MA組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);HG組與DMSO組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 1.對T-SOD及MDA含量的影響
　　 與NS組比較,HG組表現(xiàn)出T-SOD含量減少(P＜0.01),MDA水平提高(P＜0.01),差異有統(tǒng)計學意義;與DMSO組比較,SB431542組、NAC組、LY-294,002組表現(xiàn)出T-

4、SOD含量增加(P＜0.01),MDA水平下降(P＜0.01),差異有統(tǒng)計學意義。
　　 2.ROS的變化
　　 HG組檢測4 h、10 h、16 h、28 h4個時間點時ROS的釋放量,其他各組均只檢測16 h時的結果。HG組與NS組比較,在4h、10 h、16 h、28 h4個時間點HG組ROS釋放量均增加,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),且隨時間的延長,ROS的生成量有增加的趨勢;與DMSO組相比較,SB4315

5、42組、LY-294,002組及NAC組ROS的生成量均減少,且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 3.TGF-β1 mRNA水平的變化
　　 PCR結果顯示,與NS組比較,HG組、H2O2組TGF-β1 mRNA水平有所提高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與DMSO組比較,SB431542組、NAC組TGF-β1 mRNA水平下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與H2O2組比較,HS組TGF-β1 mRN

6、A水平下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4.Akt蛋白磷酸化水平的變化
　　 Western blot結果顯示,各組間總Akt蛋白表達無明顯變化(P＞0.05);與NS組比較,HG組、H2O2組P-Akt/T-Akt值升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01);與DMSO組比較,SB-431542組、NAC組p-Akt/T-Akt值降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);HS組結果與H2O2組比較

7、,p-Akt/T-Akt值降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 5.FoxO3a蛋白磷酸化水平的變化
　　 Western blot結果顯示,各組間總FoxO3a蛋白表達無明顯變化(P＞0.05);與NS組比較,HG組、H2O2組P-FoxO3a/T-FoxO3a值升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與DMSO組比較,SB431542組、NAC組、LY-294,002組P-FoxO3a/T-FoxO3a值均

8、降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);HS組結果與H2O2組比較,p-FoxO3a/T-FoxO3a值降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 6.MnSOD表達的差異
　　 與NS組比較,HG組和H2O2組MnSOD mRNA水平及其蛋白表達均降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與DMSO組比較,SB431542組、NAC組、LY-294,002組MnSOD mRNA水平及蛋白表達均升高,差異有統(tǒng)計學意義(

9、P＜0.05);與H2O2組比較,HS組MnSOD mRNA水平及蛋白表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.高糖誘導的氧化應激狀態(tài)下,大鼠MC中ROS大量生成,超量生成的ROS可上調TGF-β1,并激活其下游PI3K/Akt/FoxO3a信號通路,最終負性調控MnSOD的表達。
　　 2.高糖誘導的氧化應激狀態(tài)下,大鼠MC中MnSOD表達的減少使細胞清除ROS的能力降低,從而促使R