1、目的：
　　本研究所使用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源于SD大鼠，分離后進行體外培養(yǎng)擴增，與β-TCP材料支架共培養(yǎng)并成骨誘導(dǎo)分化，觀察材料對SD大鼠BMSCs增殖及成骨分化的影響。此外，β-TCP搭載BMP-2/PDGF-BB構(gòu)建組織工程骨修復(fù)SD大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損，觀察β-磷酸三鈣復(fù)合材料在骨組織再生修復(fù)應(yīng)用的效果，為骨生物材料的基礎(chǔ)研究，成骨及成血管提供實驗資料和科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在

2、β-磷酸三鈣復(fù)合材料中的增殖及成骨分化
　　材料使用新型β-TCP復(fù)合物（CaPfromGEM21），材料預(yù)制成直徑3.6mm，厚度1.5mm的圓盤形支架，采取雙側(cè)股骨、脛骨骨髓，用密度梯度離心法分離并擴增BMSCs，第三代BMSCs做流式細(xì)胞學(xué)檢測表面標(biāo)記物，后將第三代BMSCs與β-TCP支架于24孔培養(yǎng)板共培養(yǎng)，每個β-TCP支架種植細(xì)胞數(shù)3*105個，添加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含100nM地塞米松，10mMβ-磷酸甘油，0.05

3、mM抗壞血酸和10nM維生素D3)對BMSCs進行成骨誘導(dǎo)分化21天，對照組采用同樣方法將BMSCs種植于材料，使用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)。第1、4、7、14、21天根據(jù)實驗計劃需要進行電鏡掃描，Live/Dead染色法對細(xì)胞生長活性進行檢測，觀察成骨組及對照組BMSCs增殖。pNpp定量法對堿性磷酸酶(ALP)活性進行檢測，通過實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)測定其骨鈣素(OC)，Ⅰ型骨膠原(Col-Ⅰ)，堿性磷酸酶(ALP)及Ru

4、nX-2成骨基因的表達(dá)結(jié)果。茜素紅染色法對在材料支架進行染色并定量成骨過程形成的礦化物，觀察BMSCs在材料支架上的成骨誘導(dǎo)分化。
　　2.載骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/血小板衍生生長因子-BB的β-磷酸三鈣復(fù)合材料用于修復(fù)SD大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的實驗研究
　　材料使用復(fù)合了骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（Bone Morphogenetic Protein，BMP-2）或血小板衍生生長因子-BB（Platelet Derived Growth

5、 Factor-BB，PDGF-BB）的β-磷酸三鈣材料Calcium Phosphate from Growth-factor Enhanced Matrix21(CaPfromGEM21)，每組材料搭載BMP-2/PDGF-BB中的一種，BMP-2(濃度為10ng/100ng)/PDGF-BB(濃度為0.3ug/3ug)，另設(shè)置單純材料組、空白組各1組，共6組實驗組:(1)CaPfromGEM21;(2)CaPfromGEM21+1

6、0ng BMP-2;(3)CaPfromGEM21+100ng BMP-2;(4)CaPfromGEM21+0.3ug PDGF-BB;(5)CaPfromGEM21+3ug PDGF-BB;(6)空白組。實驗動物為健康的SPF級3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠，3％戊巴比妥鈉腹腔灌注麻醉動物，用環(huán)鉆于頂骨兩側(cè)制作兩個直徑為3.6mm的全層圓形骨缺損，兩側(cè)缺損隨機植入兩組不同的實驗材料，術(shù)后6周處死動物并取出標(biāo)本進行檢測，標(biāo)本

7、檢測方法包括:X線、Micro CT，蘇木素-伊紅染色（HE染色）及相關(guān)的定量分析。
　　結(jié)果：
　　體外擴增可見大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞生長旺盛，呈長梭形、旋渦狀或麥浪狀細(xì)胞集落成，流式細(xì)胞學(xué)檢測提示采集的細(xì)胞符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記特點。大體觀察可見間充質(zhì)干細(xì)胞在支架上生長增殖活躍，電鏡掃描圖片可以觀察到BMSCs在β-TCP支架表面貼附生長，細(xì)胞伸展形態(tài)自然，表現(xiàn)出良好的生長活力。Live/Dead染色提示細(xì)胞在支架上增殖

8、活躍，活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)定量結(jié)果提示對照組與成骨組之間在1/4/7/14天各時間點的活細(xì)胞百分比之間均無統(tǒng)計學(xué)差異;視野活細(xì)胞數(shù)定量結(jié)果提示隨培養(yǎng)時間延長，組內(nèi)活細(xì)胞數(shù)逐漸增加，成骨組第7/14天每視野活細(xì)胞數(shù)均明顯大于第1/4天，兩組間比較，同一時間點間均無統(tǒng)計學(xué)差異。ALP活性測定提示成骨組ALP活性逐步升高，而對照組則沒有明顯升高趨勢。成骨組第14/21天結(jié)果顯著大于其他時間點結(jié)果，具有統(tǒng)計學(xué)意義。qRT-PCR結(jié)果提示成骨組各成骨基因

9、在不同時間點達(dá)到峰值，成骨組ALP基因表達(dá)第四天達(dá)峰值，約為第1天5倍。COL-Ⅰ及OC基因表達(dá)峰值均出現(xiàn)在第7天，均為第1天表達(dá)量6倍，而RunX-2基因峰值出現(xiàn)在第14天，為第1天表達(dá)量約3倍。對照組各時間點成骨基因表達(dá)量則無明顯峰值出現(xiàn)。茜素紅染色可見隨培養(yǎng)時間延長，材料表面的礦物染色逐漸加深，定量分析提示成骨組第21天礦化定量顯著高于成骨組第14天及第7天，兩組間同一時間點均有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　動物手術(shù)過程無動物出現(xiàn)麻醉死

10、亡，術(shù)后無動物出現(xiàn)感染。X線影像提示各組骨缺損均有不同程度的修復(fù)，骨折線逐漸模糊，PDGF-BB組的骨缺損基本修復(fù)。Micro CT可見各組骨缺損均有不同程度新生骨長入，新生骨體積定量結(jié)果提示添加PDGF-BB組新生骨體積明顯高于BMP-2實驗組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。HE染色切片各組均未見急慢性炎癥細(xì)胞浸潤，缺損中可見染色均一的新生骨組織，新生骨內(nèi)及周圍可見散在的新生血管及其中的紅細(xì)胞，新生骨面積百分?jǐn)?shù)提示10ng BMP-

11、2組及0.3ug PDGF-BB組新生骨量百分?jǐn)?shù)均明顯大于單純材料組(P＜0.05)，新生血管密度定量提示4個添加因子的實驗組的新生血管密度均明顯大于空白組及單純材料組(P＜0.05)，4個添加因子的實驗組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　新型β-磷酸三鈣復(fù)合物材料細(xì)胞毒性小，生物相容性好，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在其表面成活生長，并保持良好旺盛的增殖及理想的成骨誘導(dǎo)效果。復(fù)合BMP-2/PDGF-BB后材料