1、如何獲得大量優(yōu)質(zhì)的種子細(xì)胞是目前軟骨組織工程亟待解決的關(guān)鍵問題.該研究首先探索一種體外高效分離、純化和培養(yǎng)骨髓MSCs的方法,及了解MSCs一般細(xì)胞生物學(xué)特性,為軟骨組織工程的功能細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).根據(jù)密度梯度離心分離的原理,抽取人骨髓標(biāo)本5ml,采用比重為1.073g/ml的Percoll分離液梯度離心制備單個(gè)有核細(xì)胞,按5.0×10<'5>/ml濃度接種于無菌的25cm2塑料培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)體系為含10％FBS的L-DMEM,48h后

2、換液除去未貼壁細(xì)胞.利用多孔培養(yǎng)板采用MTT法對(duì)培養(yǎng)的MSCs進(jìn)行細(xì)胞生長曲線測定.通過流式細(xì)胞儀技術(shù)測定MSCs的細(xì)胞周期,并選用抗CD34、CD45、CD29、CD44和HLA-DR單克隆抗體,對(duì)培養(yǎng)的MSCs進(jìn)行表型鑒定.結(jié)果發(fā)現(xiàn):培養(yǎng)的MSCs為紡錘狀,呈克隆樣生長,原代培養(yǎng)的MSCs克隆數(shù)目平均為43±11個(gè);流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,G<,0>/G<,1>、S和G<,2>/M期細(xì)胞的比例分別為88.17％、6.57％和5.27

3、％;培養(yǎng)的各代細(xì)胞對(duì)CD29和CD44表面抗原有著較高水平的陽性表達(dá)率,而對(duì)于CD34、CD45和HLA-DR表面抗原的陽性表達(dá)率卻很低,細(xì)胞純度達(dá)到99％以上.上述結(jié)果表明,通過密度梯度離心方法分離培養(yǎng)的細(xì)胞不是骨髓造血干/祖細(xì)胞,而是一群形態(tài)和表型均一的間充質(zhì)干細(xì)胞,具有獨(dú)特的增殖和表型特征及較強(qiáng)的分化潛能.該研究結(jié)果表明,采用密度梯度離心方法分離獲得的MSCs,純度高、形態(tài)和表型均一,可以在體外定向分化為軟骨細(xì)胞,在體內(nèi)局部微環(huán)境