1、【目的】
　　因創(chuàng)傷、炎癥、退變等原因?qū)е碌能浌菗p傷和缺損在臨床上十分常見。由于軟骨細(xì)胞是終末分化細(xì)胞,而且軟骨組織無直接的血液供應(yīng)和神經(jīng)支配,軟骨損傷后自身修復(fù)能力非常有限。運用組織工程技術(shù)制備的仿生人工軟骨給治愈軟骨損傷帶來了希望,但當(dāng)前大多存在種子細(xì)胞來源有限、供區(qū)受損,支架材料力學(xué)強度不夠、生物兼容性及降解率欠佳等缺點。尋找對供區(qū)無損害且來源廣泛的種子細(xì)胞,滿足一定強度要求、操作相對簡單、效果理想的組織工程化軟骨正成為目前

2、急需解決的重要問題。本實驗將取第三代兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,與Nano-HA/PLLA復(fù)合后在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)2周,自體移植修復(fù)膝關(guān)節(jié)股骨髁部軟骨缺損,同時設(shè)支架對照組和空白對照組。分別于移植術(shù)后12W、24W取材,進(jìn)行大體觀察和組織學(xué)檢測,為軟骨損傷以達(dá)到治愈奠定實驗基礎(chǔ)。
　　【方法】
　　1.取2～3月齡一健康新西蘭大白兔,體重2.0-3.0kg,無菌條件下用18號骨髓穿刺針從股骨外髁穿刺抽取骨髓3～5mL,應(yīng)用P

3、ercoll(1.073g/ml)分離液分離培養(yǎng)骨髓中兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,培養(yǎng)、傳至第3代,同時觀察細(xì)胞增殖情況。取第3代MSCs種植于Nano-HA/PLLA支架體外復(fù)合培養(yǎng)。
　　2.將18只新西蘭兔制備雙側(cè)膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損模型,直徑4.5mm,深度5mm。根據(jù)修復(fù)方法不同隨機(jī)分為A、B、C3組(n=6)。取第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與Nano-HA/PLLA復(fù)合后在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)2周,自體移植修復(fù)膝關(guān)節(jié)股骨髁部軟骨缺

4、損。A組(實驗組):將MSCs與Nano-HA/PLLA支架材料復(fù)合物植入兔雙膝缺損處;B組:將單純Nano-HA/PLLA支架材料植入兔雙膝缺損處;C組:缺損處不作任何處理,作為空白對照。
　　3.分別于術(shù)后12周和24周,取材行大體、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察,并將修復(fù)標(biāo)本按照Wakitani法組織學(xué)評分進(jìn)行評分。
　　【結(jié)果】
　　1.原代及傳代rBMSCs均表現(xiàn)為長梭、紡錘形改變,呈放射狀、渦旋狀排列,復(fù)合培

5、養(yǎng)7d后,掃描電鏡見載體表面不規(guī)則,其間可見部分微孔被細(xì)胞充填,伸展良好;復(fù)合14d后,細(xì)胞在材料空隙中粘附良好,密集處連接成片,細(xì)胞充填率達(dá)60％。
　　2.大體觀察:術(shù)后24周,A組修復(fù)組織與正常軟骨結(jié)合處完整,表面光滑,界限模糊;B、C組缺損處修復(fù)組織呈纖維組織或無修復(fù),表面不平整或呈蟲蝕樣改變。
　　3.組織學(xué)觀察:A組:12周的樣本HE染色顯示細(xì)胞數(shù)較多,但缺乏典型軟骨細(xì)胞的帶狀排列,可見多孔支架結(jié)構(gòu),缺損表面有類

6、軟骨特征的組織。番紅O染色移植區(qū)有硫酸糖胺聚糖異染。24周的樣本表面光滑,類軟骨組織增多,番紅O染色強陽性,底部形成規(guī)則的軟骨下骨,軟骨層與骨層形成一道鈣化的界面。B組:12周的樣本相對光滑的纖維組織,無軟骨層,支架多孔存在,HE染色見圓形的細(xì)胞,番紅O染色未見移植區(qū)有硫酸糖胺聚糖異染,24周時染色也未見軟骨層,番紅O也未顯示軟骨細(xì)胞形成。C組:12周的樣本有不規(guī)則和纖維的表面,24周的樣本顯示,纖維細(xì)絲在缺損中占主導(dǎo),缺損沒有完全填充

7、同時沒有軟骨層形成。
　　4.免疫組織化學(xué)染色:A組:12周時Ⅱ型膠原蛋白是整個移植區(qū)不同軟骨細(xì)胞分泌的,表面整個修復(fù)的組織被染色,局部還有密集的染色區(qū)。24周時番O染色和免疫染色顯示sGAG和Ⅱ型膠原蛋白的同一的分布,和正常軟骨相似。B、C組:缺損處幾乎既沒有含有sGAG的大片軟骨組織也沒有Ⅱ型膠原蛋白沉積。
　　5.Wakitani法組織學(xué)評分:同一時間點A組評分明顯優(yōu)于B、C組,有統(tǒng)計學(xué)意義,(P<0.05);B組與C

8、組評分無統(tǒng)計學(xué)意義,(P>0.05)。
　　【結(jié)論】
　　1.rBMSCs細(xì)胞取材方便,采用密度梯度離心法能分離獲得大量實驗用rBMSCs。rBMSCs培養(yǎng)性能穩(wěn)定,便于傳代擴(kuò)增;而且rBMSCs具有多向分化性,在一定誘導(dǎo)條件下可轉(zhuǎn)化為成軟骨細(xì)胞,適合于作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞。
　　2.以rBMSCs為種子細(xì)胞、納米羥基磷灰石/左旋聚乳酸為支架材料構(gòu)建的組織工程軟骨可作為軟骨缺損的移植材料,能較好的修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨