1、生活節(jié)奏的加快、空間的擴(kuò)展以及交通事故的頻發(fā)等因素,使骨組織損傷、骨折的發(fā)生率逐年上升,加之骨腫瘤、感染等多種原因?qū)е碌墓侨睋p的修復(fù)一直是骨科臨床工作中普遍存在并亟待解決的一大難題。目前臨床上應(yīng)用最廣泛的主要治療方法有自體骨移植、異體骨移植。但兩種方法都有一些無(wú)法避免的局限性和缺點(diǎn):如自體骨移植的來(lái)源有限、增加供體部位感染機(jī)率、引起取骨部位的創(chuàng)傷、延長(zhǎng)手術(shù)時(shí)間等缺點(diǎn)；而異體骨移植有可能傳播疾病、宿主免疫排斥反應(yīng)等。為避免或減少上述問(wèn)題,

2、應(yīng)用組織工程方法構(gòu)建人工骨修復(fù)材料為骨缺損的修復(fù)提供了希望和可能,尋找一種合適的人工骨缺損修復(fù)材料是近年來(lái)骨組織工程的研究熱點(diǎn)。骨組織工程研究中種子細(xì)胞和支架材料是最的兩大因素,支架為細(xì)胞粘附生長(zhǎng)提供可附著的基礎(chǔ),支架需要有效的支持種子細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)、分化,另外支架材料還具有一定細(xì)胞外基質(zhì)功能及適時(shí)降解性,二者是相輔相成的。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)作為骨組織工程

3、的種子細(xì)胞是目前眾多種子細(xì)胞中研究最多的細(xì)胞。BMSCs具有多分化潛能,在特定條件下能向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等分化,增殖能力強(qiáng),來(lái)源廣泛,取材方便,供區(qū)損傷小,因而倍受人們的關(guān)注。對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期的研究表明,大約有20％的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞處于靜止期,即G0期,這表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖能力。研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)12代仍能保持正常的染色體表型和端粒酶活性,在培養(yǎng)了15代之后仍保持其成骨的分化潛能。

4、組織工程人工骨不僅需要成骨能力強(qiáng)的種子細(xì)胞,更需要適宜的人工細(xì)胞外基質(zhì)(即細(xì)胞載體)材料。由于骨組織的特殊生理結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能,對(duì)骨組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料有特殊要求,理想的骨組織工程支架材料應(yīng)具備以下條件:①有良好的生物相容性,有利于復(fù)合及周圍細(xì)胞的粘附、增殖、無(wú)毒、不致畸,不引起炎癥反應(yīng)。②有效的表面活性,有利于細(xì)胞粘附、并為細(xì)胞在其表面生長(zhǎng)、增殖和分泌基質(zhì)提供良好的微環(huán)境,能激活細(xì)胞特異性基因表達(dá),維持正常細(xì)胞的表型表達(dá)。③具有三維多

5、孔結(jié)構(gòu),材料具有多空性和孔隙率,孔隙率最好在90％以上,內(nèi)表面積大,既有利于細(xì)胞的粘附和長(zhǎng)入,又利于營(yíng)養(yǎng)成分代謝產(chǎn)物的排出。④一定的可塑性:便于加工成所需要的形狀,并具有一定的機(jī)械強(qiáng)度,從而使所形成的組織具有所需的外形。⑤適宜的生物降解性:材料的降解速率應(yīng)與組織細(xì)胞的生長(zhǎng)速率相適應(yīng),應(yīng)能根據(jù)組織生長(zhǎng)特性逐步降解。生物類材料中的同種異體骨和異種骨兩者都存在免疫原性問(wèn)題,及降解過(guò)快等缺點(diǎn)。生物陶瓷類材料磷酸三鈣(TCP)、生物活性玻璃陶瓷(

6、BGC)、雙相鈣磷陶瓷(HA/TCP)為代表,具有良好的成骨能力,但存在脆性大、降解慢等缺陷,影響新生骨替代進(jìn)程和骨組織后期改建。有機(jī)材料有著良好的生物相容性、可降解性可吸收性、材料的吸收率可控制等優(yōu)點(diǎn),但親水性差,細(xì)胞吸附力較弱,材料表面缺乏細(xì)胞識(shí)別信號(hào),與細(xì)胞間缺乏生物性相互作用,聚合物中殘留的有機(jī)溶劑可引起細(xì)胞毒副作用:天然材料生物相容性好,具有細(xì)胞識(shí)別信號(hào),利于細(xì)胞黏附增殖:人工材料缺乏細(xì)胞信號(hào),但具有天然材料所不足的可以大規(guī)模

7、生產(chǎn)、可以設(shè)計(jì)和控制結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能和降解時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)?？梢?jiàn),單一類型材料一般難以滿足骨組織工程支架材料的要求,通過(guò)合適的方法將單一的生物陶瓷類與有機(jī)物材料結(jié)合,互相取長(zhǎng)補(bǔ)短,形成復(fù)合型材料,在實(shí)際應(yīng)用中取得了良好的效果。
　　 可注射性納米羥基磷灰石/殼聚糖(nano-Hydr0Xyapatite/chitosan,nHA/CS)復(fù)合材料是具有良好骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)性的納米材料,最大的特點(diǎn)為高比表面積和空隙率,有利于細(xì)胞接種、遷移和增

8、殖。因?yàn)橘N壁依賴型細(xì)胞只有在材料上黏附后,才能生長(zhǎng)和分化。其孔隙率90％,孔徑50—300μ m該材料具有較好的初始穩(wěn)定性和強(qiáng)度,既可以原位成形固化,又可以塑形,研究表明其同時(shí)具備有羥基磷灰石的和殼聚糖的特性,經(jīng)過(guò)前期的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)可注射性nHh/CS具有良好的生物相容性。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)的成骨分化能力早已為人們熟知。
　　 本實(shí)驗(yàn)研究擬在體外培養(yǎng)BMSCs,并與

9、nHA/CS復(fù)合培養(yǎng),驗(yàn)證該復(fù)合材料的生物相容性基礎(chǔ)上,制作兔股骨髁骨缺損動(dòng)物模型,富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與nHA/CS支架材料復(fù)合,對(duì)該復(fù)合物對(duì)促進(jìn)骨缺損修復(fù)中的作用進(jìn)行評(píng)估,為富集BMSCs—nHA/CS復(fù)合物在骨組織工程臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及可行性依據(jù)。
　　 內(nèi)容:
　　 1、第一部分可注射性nHA/CS復(fù)合材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物相容性研究。采用密度梯度離心法獲得兔原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow

10、StemCells,BMSCs),體外培養(yǎng)并將傳至第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與可注射性納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料共同培養(yǎng),觀察細(xì)胞與該材料的生長(zhǎng)增值情況及生物相容性。
　　 2、第二部分富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合nHA/CS修復(fù)兔骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究。建立兔股骨髁上骨缺損模型,富集第3代骨髓間充干細(xì)胞,負(fù)壓條件下將第3代BMSCs與nHA/CS材料復(fù)合,將富集BMSCs—nHA/CS復(fù)合物植入兔股骨髁上骨缺損內(nèi),術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)取材后

11、大體、組織學(xué)觀察該復(fù)合物對(duì)骨缺損的修復(fù)效果。
　　 方法:
　　 1、可注射性nHA/CS復(fù)合材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn)方法:
　　 采用全骨髓穿刺法從3周齡健康新西蘭大白兔股骨和脛骨骨髓中抽取原代兔骨髓,密度梯度離心法獲取原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,培養(yǎng)鑒定后,體外培養(yǎng)并將穩(wěn)定的傳至第3代,按一定濃度接種到納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料上,體外共同培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡、電鏡觀察接種到材料上的細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞在

12、材料上附著情況,CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性,并計(jì)數(shù)細(xì)胞接種后2、4、8、12h在材料表面的黏附狀況。并對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶活性測(cè)定。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,結(jié)果用(x)±s表示,P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同一時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞粘附數(shù)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；同組不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用多個(gè)樣本均數(shù)比較的方差分析(One-way ANOVA),組間多重比較采用LSD法。
　　 2、富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合nHA/CS修復(fù)兔骨

13、缺損的實(shí)驗(yàn)方法:
　　 36只成年新西蘭白兔,體重為1.5-2.0kg,按隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為3組:4周組、8周組、12周組(每組12只)。兔雙側(cè)股骨髁上建立直徑為7mm,深度為10mm骨缺損空腔,將BMSCs-nHA/CS復(fù)合物植入右側(cè)骨缺損作為實(shí)驗(yàn)組,左側(cè)植入單純nHA/CS材料作為對(duì)照組,其中每組中4只兔兩側(cè)骨缺損不植入任何材料作為空白對(duì)照組。分別于4、8、12周末取材觀察:①大體觀察材料植入后動(dòng)物的生命活動(dòng)狀況,并觀察標(biāo)本

14、骨缺損修復(fù)愈合狀況；②X線、CT橫斷面掃描及三維重建進(jìn)一步通過(guò)影像學(xué)對(duì)骨缺損愈合狀況進(jìn)行評(píng)估；③骨密度值測(cè)量比較實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組的差異情況。④組織學(xué)切片觀察骨缺損處與材料交界部位新生骨形成,材料降解及骨缺損愈合的組織學(xué)變化過(guò)程；
　　 結(jié)果:
　　 1、可注射性nHA/CS復(fù)合材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 ①倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞圍繞在nHA/CS復(fù)合材料邊緣生長(zhǎng),隨著時(shí)間的遞增,細(xì)

15、胞數(shù)目逐漸增加,生長(zhǎng)狀況良好。
　　 ②電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附在nHA/CS材料表面上生長(zhǎng)良好,部分細(xì)胞伸出偽足長(zhǎng)入材料孔隙里。
　　 ③黏附數(shù)測(cè)定結(jié)果表明,細(xì)胞接種到納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料2h時(shí)兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),材料組黏附數(shù)低于對(duì)照組；但接種4 h,8h,12h后兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.91、0.084、0.081),材料組細(xì)胞粘附數(shù)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

16、br>　　 ④CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性:細(xì)胞密度從最初培養(yǎng)到7天至平臺(tái)期后達(dá)到最大。材料組和對(duì)照組在最初7天均呈相同的逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì),第7天時(shí)達(dá)到最大值。細(xì)胞和材料共同培養(yǎng)后增殖細(xì)胞沒(méi)有明顯改變,nHA/CS對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)及增值活性沒(méi)有明顯影響。
　　 2、富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合nHA/CS修復(fù)兔骨缺損的研究結(jié)果:
　　 所有實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后2天后完全恢復(fù)正常飲食水。5天后手術(shù)切口均Ⅰ期愈合,兔活動(dòng)狀態(tài)如術(shù)前。觀察期間兔下肢未

17、出現(xiàn)感染現(xiàn)象。
　　 ①大體觀察:實(shí)驗(yàn)組:4周后尚可見(jiàn)缺損區(qū)域,纖維組織覆蓋缺損區(qū)；8周后缺損區(qū)凹陷變平整,表面光滑,有光澤,按壓移植部位可有部分阻抗；12周后骨缺損區(qū)域完全修復(fù),股骨形狀基本恢復(fù)到術(shù)前形態(tài),按壓移植部位阻抗與周邊正常骨組織相似。對(duì)照組:4周后缺損區(qū)可見(jiàn)；8周后缺損區(qū)與周圍界限變模糊,表面欠光滑,顏色稍暗,按壓移植部位稍有阻抗；術(shù)后12周骨缺損區(qū)域與周圍界限不能分辨,色澤與周圍無(wú)明顯差異,按壓移植部位有一定的阻抗

18、,但有部分骨皮質(zhì)缺損,僅纖維組織填充?？瞻捉M:4周后缺損腔仍在,纖維結(jié)締組織覆蓋缺損；8周后缺損區(qū)見(jiàn)肉芽組織填充空腔,缺損區(qū)沒(méi)有阻抗,按壓即部分塌陷。12周缺損區(qū)見(jiàn)大量肉芽部分填充缺損修復(fù)效果差。
　　 ②X線、CT檢查結(jié)果:
　　 實(shí)驗(yàn)組:4周時(shí)材料與正常骨組織之間有一環(huán)狀的界限,缺損仍可見(jiàn)；8周時(shí)正常骨組織與材料界限模糊,缺損區(qū)域透光性稍低于周圍宿主骨組織,正常骨組織與材料界限模糊,外層骨皮質(zhì)已有連接；12周末組骨缺

19、損完全修復(fù),原缺損空腔有新生骨組織,CT顯示缺損修復(fù)區(qū)域與周圍骨組織密度基本相同。
　　 對(duì)照組:4周時(shí)骨缺損區(qū)域仍可見(jiàn),材料與周圍組織之間界限尚清晰明顯；8周時(shí)缺損區(qū)域較前明顯減小,缺損區(qū)透光性低于周圍宿主骨組織,但外層骨皮質(zhì)不連續(xù)；12周時(shí)骨缺損較前進(jìn)一步減小,骨缺損見(jiàn)部分骨性修復(fù),仍有部分骨皮質(zhì)不連續(xù)。
　　 空白組:4周缺損明顯,未見(jiàn)愈合征象；8周后缺損空腔見(jiàn)纖維組織填充,見(jiàn)肉芽組織填充缺損,未見(jiàn)骨性組織填充；1

20、2周時(shí)缺損邊緣見(jiàn)硬化,缺損空腔密度明顯低于骨周圍組織密度,未見(jiàn)明顯骨性成分修復(fù)。
　　 ③12周時(shí)CT三維重建:
　　 實(shí)驗(yàn)組:骨缺損已基本完全修復(fù),未見(jiàn)明顯骨缺損空腔；對(duì)照組有部分新骨長(zhǎng)入,但缺損空腔仍可見(jiàn),缺損空腔仍存在；空白組修復(fù)效果最差,骨缺損空腔明顯存在。
　　 ④骨密度值測(cè)量:隨時(shí)間增加,各組骨密度值逐漸增加,4周、8周、12周末時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及空白組比較骨密度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),在

21、各個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組骨密度值均大于對(duì)照組和空白組,方差分析比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組骨密度值高于對(duì)照組及空白組。
　　 ⑤組織形態(tài)學(xué)觀察:
　　 實(shí)驗(yàn)組:4周時(shí)復(fù)合材料與宿主骨交界有少量新骨形成,有纖維骨痂形成,材料與骨組織生物相容性好；8周時(shí)出現(xiàn)大量排列較整齊的新生骨小梁,可見(jiàn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng),并可見(jiàn)少量板層狀樣骨組織,材料有部分降解；12周時(shí)可見(jiàn)大量新生板層骨組織,見(jiàn)成骨細(xì)胞較多,大量新骨原缺損區(qū)被新生板層

22、骨組織填充,材料大部分降解。
　　 對(duì)照組:4周時(shí)纖維軟組織長(zhǎng)入材料,缺損邊緣可見(jiàn)少量纖維性骨痂形成；8周后,缺損區(qū)有新生成骨細(xì)胞,未見(jiàn)板層骨形成,材料部分降解；12周后少量板層樣骨組織形成,但仍有部分骨缺損區(qū)域由纖維組織填充,材料亦大部分降解。
　　 空白組:4周時(shí)纖維軟組織長(zhǎng)入材料,也可見(jiàn)淋巴細(xì)胞等,缺損邊緣可見(jiàn)少量纖維骨痂形成；8周后見(jiàn)邊緣有少量成骨細(xì)胞,纖維結(jié)締組織長(zhǎng)滿空腔；12周時(shí)見(jiàn)有纖維肉芽組織形成,但缺損中

23、心區(qū)域未見(jiàn)成骨細(xì)胞形成。
　　 結(jié)論:
　　 1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在可注射nHA/CS材料上正常生長(zhǎng)、增殖、分化,體外實(shí)驗(yàn)表明該材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性,具有良好的生物相容性。
　　 2.富集BMSCs-nHA/CS對(duì)兔股骨骨缺損修復(fù)效果較單純nHA/CS凝膠材料好,而后者又優(yōu)于空白組,單純nHA/CS材料組修復(fù)效果優(yōu)于空白組,說(shuō)明nHA/CS材料參與了骨的修復(fù)；細(xì)胞支架復(fù)合體組的修復(fù)效果優(yōu)于支架組和空白組,說(shuō)明體外擴(kuò)增